米櫧葉片基因組DNA的提取及分析

林莉莉，郭麗倩，陳瀟瀟，游章湉，游水生，曹世江

(1.福建農林大學林學院，福建 福州 350002； 2.浙江大學農業與生物技術學院，浙江 杭州 310027；3.中國科學院華南植物園退化生態系統植被恢復與管理重點實驗室、中國科學院華南植物園廣東省應用植物學重點實驗室，廣東 廣州 510650)

米櫧(Castanopsiscarlesii(Hemsl.)Hay.)為殼斗科栲屬喬木，是東亞地區具有代表性的建群種，是亞熱帶地區的常綠闊葉林組成樹種之一。它不僅適應溫暖濕潤多雨的氣候，同時也能耐蔭，耐瘠薄干旱，適應性強，在福建、湖北、四川、貴州、臺灣、日本等地區廣泛分布[1-3]。米櫧生長迅速，抗風力強，又耐煙塵、抗污染并能殺菌，在營造防火林帶中有著廣闊的應用前景和發展潛力[4-5]。由于現階段我國亞熱帶地區經濟發展迅速，人口密度增加，人類對米櫧群落的干擾影響比較嚴重，加之采伐強度大，導致米櫧群落退化嚴重[6]。因此開展米櫧DNA提取研究對其分子生物學以及遺傳多樣性等方面具有重要意義。

高質量的DNA是進行基因檢測的重要基礎，PCR為基礎的基因檢測技術在遺傳多樣性、遺傳分析、親緣關系等各個方面都有廣泛的應用[7]，所以得到高質量的DNA是有效用于PCR擴增、基因克隆、基因圖譜、進化進程分析的重要基礎，是成為植物分子技術分析的首要前提[8-10]。因此出現了針對各種栲屬植物，如赤枝栲(Castanopsiskawakamii)[11]、格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)[12]、絲栗栲(CastanopsisfargesiiFranch)[13]、紅錐(CastcmopsishystrixA.DC)[14]等植物基因組DNA提取方法的研究，采用了檸檬酸鈉法、尿素法、高鹽低pH法、SDS法、傳統CTAB法和試劑盒提取這6種方法，但至今尚未見有關米櫧基因組DNA提取方法的研究報道，參考現有的栲屬植物基因組DNA提取方法。本研究采用改良的CTAB法來提取米櫧基因組DNA，以期找到高效提取米櫧基因組DNA的方法，為其后續PCR、遺傳分析等方面的研究及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗所用的米櫧葉片采自福州鼓山風景區，根據人類干擾程度的大小選擇6個不同的米櫧群落(表1)，于2016年6月采集新鮮葉片，凍存于-80 ℃冰箱內。

表1 6個米櫧群落的概況

1.2 試劑與儀器

主要試劑為DNA提取緩沖液(100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，20 mmol·L-1EDTA，pH 8.0，1.0 mol·L-1NaCl，2%(w/v)CTAB，0.5%β-巰基乙醇(使用時現加入))，氯仿，異丙醇，75%乙醇，ddH2O等，所用試劑均為分析純。主要儀器有：低溫離心機，干式恒溫器，PCR儀，電泳儀，超微量分光光度計DeNovix，電泳凝膠成像數據分析系統。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 秤取米櫧葉片0.05 g于干燥的研缽內，加入適量液氮研磨成粉末，轉入1.5 mL離心管中并加入預處理的DNA緩沖液500 μL，65 ℃水浴30 min，期間每隔10 min混勻1次；4 ℃，13000 r·min-1離心2 min，取上層水相并加入氯仿500 μL，混勻后靜置2 min；4 ℃，13000 r·min-1離心15 min，取上層水相，加入等體積已加入10%NaAC的異丙醇，上下顛倒混勻，在-20 ℃下醇沉30 min。4 ℃，13000 r·min-1離心15 min，收集沉淀，加入75%乙醇溶解、洗滌；4 ℃，13000 r·min-1離心3 min，重復2次；置于通風櫥數分鐘，待管內乙醇揮發殆盡，加入ddH2O 100 μL，震蕩混勻即為所提取的基因組DNA。

1.3.2 DNA檢測 取1 μL DNA樣品于超微量分光光度計DeNovix上測定DNA濃度、A260/230、A260/280。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性，并拍照記錄。

1.3.3 PCR檢測 以米櫧葉片提取的DNA作為模板進行PCR檢測。用trnL為引物進行PCR擴增(表2)，反應體系為模板500ng、引物10 pM、ddH2O 8 μL、Master Mix10 μL。反應程序為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，進行40個循環；再于72 ℃延伸10 min[15]。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過電泳凝膠成像數據分析系統觀察并采集圖像。

表2分子標記引物序列

2 結果與分析

2.1 米櫧葉片DNA的質量濃度和純度

表3是經超微量分光光度計檢測所得的每個米櫧群落內5個米櫧葉片樣品DNA濃度和純度的平均值。結果表明，試驗中所提取的DNA，A260/230值均在2.0左右，說明純度較高，多糖等雜質較少；A260/280的值均在2.0左右，說明DNA中還有少量的RNA，但不影響后續試驗操作。試驗提取的米櫧DNA質量濃度均在400～750 ng·μL-1之間，DNA得率在80～120 mg·g-1之間，在微量試驗中產率較高，說明本方法能夠有效的提取到米櫧分子生物實驗的DNA質量。

表3 6個米櫧群落內葉片DNA質量濃度和純度的平均值

圖1 米櫧基因組DNA的紫外吸收曲線

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

圖3 以trnL為引物的PCR擴增產物電泳圖

圖4 米櫧PCR產物測序結果

圖5 米櫧基因測序部分波峰圖

2.2 米櫧葉片基因組DNA的質量

試驗結果發現，采用該方法所獲得的沉淀物能夠較好地溶解于乙醇中，在提取過程中多酚類物質影響較小。由圖1、圖2可知，采用該方法提取的米櫧葉片基因組DNA質量好，經過1%瓊脂糖凝膠電泳后，條帶明顯，且只有1條清晰的主帶，“拖尾”現象較小，DNA降解和RNA污染的現象也輕，DNA質量穩定。

2.3 PCR擴增結果

圖3是以采用trnL為引物的PCR擴增電泳結果。由圖3可得，采用本文改良的CTAB法所獲得的DNA結果，在trnL引物和反應體系中能夠得到穩定的擴增片段，長度約為800 bp，主帶清晰、明顯，無雜帶，重復性好。由此可見，采用該方法所提取的米櫧DNA質量高，可以應用于以PCR為基礎的分子生物研究。

2.4 米櫧葉片基因組DNA測序結果

將PCR擴增結果送到鉑尚生物技術有限公司測序得到結果。結果表明本次測定的序列長度均在800 bp左右，圖4為第5號米櫧群落樣品的測序結果之一，序列長度為788 bp，與YU-PIN CHENG利用該引物測序所得結果801 bp相似度高達97.3%[15]，在該基因中A占35.2%，G占15.6%，T占33.2%，C占16.0%，且基因測序結果有效區間的波峰圖中主峰明顯，沒有特異性條帶干擾(圖5)。因此利用該方法提取的DNA可用于米櫧遺傳多樣性的分析。

3 討論與結論

米櫧屬于頑拗植物，細胞中多糖、酚類、單寧等物質含量較多[16]，在提取過程易褐化形成粘稠的物質，嚴重影響實驗操作。通過前期的試驗摸索，從中找到適合米櫧基因組DNA提取的方法。本次試驗提取液中NaCl的含量為1.0 mol·L-1，用量減少，加入0.5%的β-巰基乙醇相較于常見植物DNA提取方法中的0.1%[17]用量有所增加，能夠有效地減少提取過程的褐變，與現有格氏栲的方法中3%[12]相比，本方法的用量降低了操作過程的毒性。實驗省略了酚氯仿的使用，且氯仿在該過程中只使用1次，又進一步減少了實驗操作中的毒性。本方法使用10%的醋酸鈉去除基因組DNA中糖類的干擾，在-20 ℃下用異丙醇代替75%乙醇能使DNA更易醇沉。該方法使用的試劑均為實驗室常見試劑，操作簡單，提取過程相對于試劑盒提取基因組DNA消耗時間少，整個操作時間在2 h左右，且在操作過程中有效調整了β-巰基乙醇的用量，減少氯仿的使用次數，省略了酚氯仿這些有毒物質的使用，相較于傳統的CTAB法，本方法毒性較小，操作簡單，用時少；相對于試劑盒提取，本方法更加經濟實用。

葉綠體是植物細胞質遺傳的重要單位，具有相對獨立的遺傳物質(cpDNA)[18]。葉綠體基因組在植物分子標記[19]、系統發育基因組學[20]等方面有廣泛的應用。本試驗使用的材料為福州鼓山米櫧的葉片，采用幼葉和成熟葉片均能達到良好的效果。利用紫外分光光度計檢測，在6個米櫧群落樣品中均提取到了較好的基因組DNA，提取過程中有效降低了DNA的降解，同時實驗結果能夠用于PCR擴增DNA模板。基因組DNA和PCR擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳中均能夠得到穩定的條帶，PCR產物條帶清晰，“拖尾”現象較少，且擴增結果能夠得到穩定序列結果，為今后對米櫧不同種群間的遺傳序列分析、基因定位等研究提供了較好的DNA提取方法。且利用本方法提取格氏栲(CastanopsiskawakamiiHayata)的基因組DNA也取得了比較好的結果，因此本方法能夠為米櫧和格氏栲等其它栲屬植物的DNA提取以及其它分子研究提供參考。