TBX15基因啟動子甲基化在肝細胞癌中的表達及其功能研究

龐婷 劉順 仇小強 李沭 秦小玲 李柯樺 劉美良 伍柳玉 曾小云

作者單位：530021 南寧 廣西醫科大學公共衛生學院流行病與衛生統計學教研室

人類 TBX15（T-box transcription factor 15，TBX15）是T-box基因家族的成員之一，其編碼的生物蛋白是一種對疾病發展至關重要的轉錄因子［1］。大量研究表明，轉錄因子TBX15的甲基化水平可能影響人類腫瘤的發生發展，如卵巢癌［2］、乳腺癌［3］、甲狀腺癌［4］、前列腺癌［5］和腎細胞癌［6］等，然而TBX15基因與肝細胞癌（簡稱“肝癌”）發生發展關系的研究尚未見報道。全基因組DNA甲基化分析表明，TBX15在肝癌中高度甲基化且表達下調［7］。本課題組利用TCGA數據庫的肝癌數據對TBX15基因進行生物信息學整合分析也發現，TBX15基因在肝癌中啟動子的甲基化程度與mRNA表達呈負相關，且與肝癌患者預后相關，據此推測TBX15基因可能在肝癌的發生發展中發揮重要作用。本研究通過分析不同肝癌細胞系中TBX15基因啟動子甲基化對mRNA表達的調控及對腫瘤細胞生物學行為的影響，以進一步了解該基因在肝癌發生發展中的調控機制，為肝癌的精準治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

人肝癌細胞株HepG2、MHCC97H和SNU449購自廣州賽庫生物技術有限公司；TBX15及GAPDH引物由廣州英贊生物科技有限公司合成；Lipofectamine 2000 Transfection Reagent購自上海博耀生物科技有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa公司；0.25%胰蛋白酶及CCK-8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司；實時熒光定量PCR（ABI StepOne Plus）儀購自美國ABI公司；凝膠成像系統（JS-1075）購自上海培清科技有限公司；倒置熒光顯微鏡（CKX41）購自日本Olympus公司。

1.2 構建TBX15過表達載體

根據UCSC基因組生物信息庫查找TBX15基因的序列，對TBX15基因序列及pcDNA3.1（+）載體序列進行分析，以人脂肪干細胞mRNA反轉錄的cDNA為模板，PCR擴增基因序列，將目的基因片段構建到pcDNA3.1（+）載體中，再用KpnI和XbaI對上述PCR產物和載體進行雙酶切，反應條件：37℃水浴，30 min；80℃滅活，10 min。酶切后按照Axygen純化試劑盒說明書進行產物純化，將酶切產物與T載體進行連接和轉化，取菌液均勻涂在平板上，于37℃培養12 h。選取上述平板上的單菌落，送測序公司測序，進行下一步鑒定。

1.3 細胞培養和轉染

人肝癌細胞株HepG2、MHCC97H和SNU449培養于含1%雙抗的DMEM培養液和10%胎牛血清中，培養條件：5%CO2、37℃，飽和濕度，每2~3 d換液傳代1次。按照Lipofectamine 2000 Transfection Reagent轉染試劑盒說明書將空白質粒、空載質粒pc3.1及TBX15過表達質粒轉染至肝癌SNU449細胞。分別將5 μg DNA 和 15 μL Lipofectamine 2000 轉染試劑與500 μL Opti-MEM培養基混勻。再把上述2管溶液混合為轉染復合物，室溫靜置孵育10 min。將孵育后的轉染復合物均勻加入培養瓶中，培養6 h后換成完全培養基。繼續培養2~4 d后提取RNA，采用qPCR檢測轉染后3組質粒細胞的mRNA表達水平，收集細胞進行后續功能實驗。

1.4 亞硫酸氫鹽測序法檢測肝癌細胞中TBX15的甲基化狀態

提取 HepG2、MHCC97H和 SNU449肝癌細胞DNA，按照 EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit（QIAGEN）試劑盒說明書對DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。利用Methprimer在線預測CpG島軟件設計引物，外側（-489~23 bp，516 bp） 上游引物序列：TGTTGTAAGGTGGGAGAGTTGATTT，下游引物序列：AAAACCATAACTTTCCCAACCAAC；內側（-364~-92 bp，277 bp）上游引物序列：TATGATTGGTTTGTTTGGTTTTTTAG，下游引物序列：CTAACCATTCTTAATTCCCACACCT。配制反應體系進行PCR擴增，反應條件：95℃5 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，30 個循環，72 ℃ 5 min。按照Axygen凝膠純化試劑盒說明書進行PCR產物純化，回收片段。將目的片段DNA與線性化載體連接和轉化，取菌液均勻涂在平板上，于37℃過夜培養。選取上述平板上的單菌落，送測序公司測序進行下一步鑒定。

1.5 qPCR檢測不同肝癌細胞中TBX15 mRNA的表達

按照Qiagen試劑盒中的步驟提取HepG2、MHCC97H和SNU449肝癌細胞的總RNA，用Nanodrop2000超微量分光光度計測定RNA的濃度和純度，核酸電泳儀測定RNA的完整性。逆轉錄cDNA，TBX15上游引物序列：GGTGTGGGCGGCTAAAATGA，下游引物序列：GCTCTGCTCAGAATCCGGG。內參GAPDH上游引物序列：GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下游引物序列：GAAGATGGTGATGGGATTTC。按照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書，每組為20 μL的Real-time PCR體系，每孔設3個復孔。反應條件：95℃30s，95℃5 s，60℃30 s，40個循環。取PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳，電壓120 V，15 min。實時熒光定量結果采用相對定量分析法，采用2-△△Ct方法計算TBX15基因的mRNA 表達量［8］。

1.6 Western blot檢測肝癌細胞中TBX15蛋白的表達

取轉染后的空白質粒組、空載質粒pc3.1組以及TBX15過表達質粒組肝癌SNU449細胞，加入200 μL裂解液在冰上裂解30 min，4℃、13 000 r/min離心30 min，然后移取上清至潔凈離心管中。將高濃度待測蛋白以一定倍數稀釋后與4×Loading Buffer以3∶1的體積比混合，沸水浴5 min，取出樣品管置于冰上，待其恢復至室溫后離心震蕩，按照上樣順序點樣，電泳30 min。以濕轉法將蛋白轉移至PVDF膜，將膜浸入5%BSA的封閉液中，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，浸于1×TBS-T緩沖液中，于搖床上緩慢洗滌15 min。然后移入第一抗體中，4℃下孵育過夜。加入有對應HRP標記的第二抗體中，室溫搖床孵育1 h。采用ECL化學發光顯色，移至凝膠成像分析儀中，曝光顯影。用Image J軟件對目的條帶進行灰度值計算，以內參為基數，計算公式：相對灰度值=TBX15基因灰度值/GAPDH基因灰度值。

1.7 CCK-8法檢測肝癌SNU449細胞的增殖情況

采用CCK-8法檢測轉染空白質粒、空載質粒pc3.1和TBX15過表達質粒后肝癌SNU449細胞的增殖情況，實驗重復3次。取上述3組處于對數生長期的細胞，分別加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL，消化至細胞變圓脫落，加入全培養液5 mL終止消化，吹打成細胞懸液并轉移至15 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入檢測培養液3 mL重懸細胞并計數，將細胞密度調整至 1×105個/mL，以 100 μL/孔加入96孔板中，每組細胞設置2個復孔。細胞孵育24 h、48 h、72 h后分別加入CCK-8顯色液，于37℃、5%CO2培養箱中孵育60 min。取出96孔板于酶標儀讀取各孔OD450吸光值。計算細胞增殖抑制率，計算公式：細胞增殖抑制率=［1-（過表達質粒組吸光值/空白質粒組或空載質粒組吸光值）］×100%。

1.8 流式細胞術檢測肝癌SNU449細胞的凋亡情況

采用流式細胞術檢測轉染空白質粒、空載質粒pc3.1和TBX15過表達質粒后肝癌SNU449細胞的凋亡情況，實驗重復3次。將上述3組細胞懸液計數后，取約1.5×105個細胞置于離心管中，1200r/min離心5 min，棄上清液。然后分別加入 150 μL 1×Binding Buffer，重懸（理想濃度為106個細胞/L）后分成實驗樣品管和陰性對照管，實驗樣品管加入5μLAnnexinV-PE和5μL7-AAD染料，陰性對照管不加任何染料。室溫下避光孵育15 min，分別加入 200μL1×AnnexinVBindingBuffer，1h內上機。

1.9 統計學方法

本研究實驗數據經Excel整理后采用SPSS 17.0軟件進行分析。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間差異比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若整體差異有統計學意義，進一步兩兩比較采用LSD法。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TBX15基因在3種肝癌細胞中的甲基化狀態

采用TBX15啟動子引物對亞硫酸氫鹽修飾的DNA進行PCR擴增，根據BSP結果計算啟動子甲基化率。結果顯示，肝癌HepG2、MHCC97H、SNU449細胞均發生了異常甲基化，其啟動子甲基化率分別為57.4%、78.9%和89.5%，其中TBX15啟動子在肝癌SNU449細胞中甲基化程度最高。

2.2 3種肝癌細胞中TBX15 mRNA的表達水平

采用qPCR檢測3種肝癌細胞中TBX15 mRNA的表達水平，擴增曲線、溶解曲線良好。以肝癌MHCC97H細胞檢測的2-△△Ct值為1，計算其余細胞的平均 2-△△Ct值。結果顯示，TBX15 mRNA在肝癌SNU449細胞中幾乎不表達，在肝癌HepG2細胞中高表達，組間差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.3 構建TBX15過表達載體

分別將空白質粒、空載質粒和TBX15過表達質粒轉染至甲基化程度最高和TBX15 mRNA表達水平最低的肝癌SNU449細胞，以空白質粒組的2-△△Ct值為1，計算其余各組的平均2-△△Ct值。qPCR結果顯示，TBX15過表達質粒組TBX15 mRNA的相對表達量為1 385.28±18.19，空載質粒組和空白質粒組分別為 1.14±0.30 和 1.00±0.16，TBX15 過表達質粒組TBX15 mRNA的相對表達量較其余兩組顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01），空載質粒組和空白質粒組差異無統計學意義（P=0.450），見圖 2。采用Western blot檢測3組細胞中TBX15蛋白的表達水平，結果顯示，與空白質粒組和空載質粒組細胞相比，TBX15過表達質粒組細胞中TBX15蛋白表達明顯上調，見圖3。以上結果說明TBX15過表達載體構建成功。

圖1 3種肝癌細胞系中TBX15 mRNA的表達水平Fig.1The mRNA expression levels of TBX15 in three HCC cell lines

圖2qPCR檢測3組細胞中TBX15 mRNA的表達Fig.2 qPCR detecting the TBX15 mRNA expression in three groups

圖3 Western blot檢測3組細胞中TBX15蛋白的表達Fig.3 Western blot detecting the TBX15 protein expression in three groups

2.4 過表達TBX15對肝癌SNU449細胞增殖能力的影響

CCK-8檢測結果顯示，培養24 h后，空白質粒組、空載質粒組和TBX15過表達質粒組肝癌SNU449細胞的OD值差異無統計學意義（F=1.525，P=0.291）；培養48 h后，3組OD值差異有統計學意義（F=9.353，P=0.014），兩兩比較發現，TBX15過表達質粒組肝癌SNU449細胞的增殖能力較空載質粒組強（P=0.015）；培養72 h后，3組細胞的OD值差異無統計學意義（F=0.326，P=0.734），見表 1。

表1 CCK-8檢測不同質粒轉染組肝癌SNU449細胞的OD值Tab.1 CCK-8 detecting the OD values of SNU449 cells in different plasmid groups

2.5 過表達TBX15對肝癌細胞凋亡的影響

流式細胞術檢測結果顯示（圖4），空白質粒組、空載質粒組和過表達質粒組肝癌SNU449細胞的早期凋亡比例差異有統計學意義（F=13.609，P=0.006），且兩兩比較發現，過表達質粒組肝癌SNU449細胞的凋亡能力高于空白質粒組（P=0.002）；3組細胞晚期凋亡比例差異無統計學意義（F=1.144，P=0.379）；3組細胞總凋亡比例差異有統計學意義（F=6.059，P=0.036），兩兩比較發現，過表達質粒組肝癌SNU449細胞的凋亡能力高于空白質粒組（P=0.014），見表2。

圖4 流式細胞術檢測不同質粒轉染組肝癌SNU449細胞的凋亡情況Fig.4 Flow cytometry detecting the apoptosis of SNU449 cells in different plasmid groups

表2 流式細胞術檢測不同質粒轉染組肝癌SNU449細胞的凋亡比例Tab.2 Flow cytometry detecting the apoptosisproportion of SNU449 cellsin differentplasmid groups

3 討論

腫瘤抑制基因的表觀遺傳沉默是導致人類癌癥發生、進展的主要事件，這些基因啟動子區域中的CpG島超甲基化是腫瘤抑制因子表達失活的重要機制［9］。越來越多的研究證明，DNA在腫瘤患者中甲基化異常與腫瘤分化差、侵襲高和不良預后等有關［10-11］，因此DNA甲基化可能成為不同類型腫瘤的潛在診斷和預后標志物。本研究結果顯示，TBX15基因在肝癌MHCC97H和SNU449細胞中呈高度甲基化狀態，在肝癌HepG2細胞中呈中度甲基化狀態。采用qPCR檢測3株細胞TBX15 mRNA的表達水平，發現TBX15 mRNA在肝癌MHCC97H和SNU449細胞中表達失活，證實了啟動子高甲基化與肝癌中TBX15表達缺失有關，提示DNA甲基化可能是導致肝癌TBX15基因沉默的主要機制。

研究表明，在某些特定腫瘤中，由于啟動子中CpG島的超甲基化，許多腫瘤抑制基因功能缺失，可能抑制腫瘤的發生發展［12］。研究發現，越來越多的基因甲基化參與肝細胞的癌變和轉移［13-14］。LI等［3］研究發現TBX15可通過抑制腫瘤細胞增殖和轉移而阻礙乳腺癌的發生發展。本研究體外功能實驗結果顯示，轉染過表達TBX15質粒48 h后，發現可促進肝癌SNU449細胞增殖，與上述研究結果不一致，原因可能是觀察24 h后部分細胞還未轉染成功，而這部分細胞還可以繼續分裂增長，在轉染48 h后3組細胞增長的速度開始出現明顯差異，72 h后趨于平穩。ARRIBAS等［4］研究發現TBX15過表達可以改變促凋亡/抗凋亡蛋白質的比例，下調線粒體凋亡，促使細胞色素c降低，裂解減少，從而抑制腫瘤細胞凋亡。然而本研究發現過表達TBX15促進了肝癌細胞的凋亡，具體機制尚未知。以上結果提示TBX15基因在肝癌惡變和轉移中可能發揮促癌與抑癌的雙重功能。

既往研究認為細胞分化和增殖紊亂是惡性腫瘤發生機制的全部內容［15］，近年發現腫瘤細胞喪失自發凋亡能力也是其發病的重要機制之一，腫瘤細胞在快速增殖的同時可能也伴隨著細胞凋亡。本研究發現過表達TBX15誘導肝癌SNU449細胞凋亡能力可能比細胞增殖能力強，在一定程度上抑制腫瘤細胞的進展，提示TBX15基因可能是治療肝癌的潛在靶點。

綜上所述，TBX15基因啟動子甲基化可能與肝細胞癌惡性生物學行為相關，為研究肝癌的發生進展機制提供新的方向。本研究僅在肝癌SNU449細胞中進行功能研究，未能充分排除腫瘤異質性的影響，而TBX15基因在其他肝癌細胞株是否發揮相同作用尚未知。此外，本研究僅在細胞水平進行功能探討，仍需在多種肝癌細胞株和動物實驗中驗證。