吡格列酮對人胰腺癌細胞株PANC-1增殖、凋亡的影響及分子機制研究

李俊玲 張敬毅 闞方功 翟愛娣 郝瑩

作者單位：255200 淄博 山東省淄博市第一醫院藥學部

胰腺癌（pancreatic cancer）是消化道系統惡性程度較高的惡性腫瘤，預后較差［1］。2015年統計數據顯示，我國胰腺癌病死率居腫瘤相關死亡的第6位［2］。臨床上以吉西他濱（gemcitabine）等化療藥物治療胰腺癌的效果不理想，患者總體生存期僅為6.8個月［3］。尋找新的有效抗胰腺癌藥物，對提高患者生存時間，改善預后具有十分重要的意義。吡格列酮（pioglitazone）是噻唑烷二酮類藥物，屬于胰島素增敏劑，臨床上常用于治療2型糖尿病［4］。近年來研究發現，吡格列酮可能通過上調PPARγ表達而抑制胃癌細胞生長，并促進細胞凋亡［5］。然而其在胰腺癌中的作用至今鮮有報道，基于此，本研究通過分析吡格列酮對人胰腺癌細胞株PANC-1增殖、凋亡的影響，旨在探討吡格列酮對胰腺癌的分子作用機制，以期為臨床診治提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰腺癌細胞株PANC-1購自北納創聯生物技術有限公司，吡格列酮（純度98%）購自上海科順生物科技有限公司，吉西他濱（純度98%）購自上海恒斐生物科技有限公司，Bcl-2、Bax、caspase-3 抗體與 ERK、p-ERK抗體及β-actin購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，PI/RNase購自廈門研科生物技術有限公司，AnnexinVFITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海一基實業有限公司，RP-MI1640培養基購自上海研生實業有限公司，DAPI染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

將胰腺癌細胞株PANC-1常規培養至RP-MI1640培養基（10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養，待70%～80%細胞貼壁融合時，采用胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞進行后續實驗。

1.3 CCK-8法檢測胰腺癌細胞增殖情況

調節細胞濃度，并以每孔1×103個/mL細胞接種于96孔板，隨機分為0 μmol/L吡格列酮組、10 μmol/L吡格列酮組、20 μmol/L吡格列酮組、50μmol/L吡格列酮組、50 μmol/L吉西他濱組（以下實驗均以此分組）。每組細胞設置6個復孔，并置于37℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。待細胞貼壁后，分別加入終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮及 50 μmol/L 的吉西他濱，分別于培養 0 h、12 h、24 h、48h、72h時，各孔細胞加入0.01mL的CCK-8，培養結束后，在全自動酶標儀上測定各孔吸光度值（OD490），計算細胞存活率（%）=OD490實驗組/OD490空白對照組×100%（0 μmol/L 吡格列酮組為空白對照組，10 μmol/L吡格列酮組、20 μmol/L 吡格列酮組、50 μmol/L 吡格列酮組、50 μmol/L吉西他濱組為實驗組），并篩選合適的藥物作用時間。

1.4 流式細胞術檢測胰腺癌細胞周期

將對數生長期細胞濃度調至1×105個/mL，并接種于6孔板中，按照1.3的方法分組，于常規37℃培養箱中培養，待細胞生長至90%融合時，分別加入終濃度為 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮及50 μmol/L的吉西他濱，繼續培養48 h，然后收集各組細胞，PBS洗滌2次，棄上清液，70%酒精固定，4℃過夜，PBS洗滌后將細胞重懸于PI/RNase染色緩沖液中，37℃避光孵育30 min后，采用流式細胞儀檢測，計算G0/G1期、S期、G2/M期細胞比例。每組實驗均重復3次。

1.5 流式細胞儀檢測胰腺癌細胞凋亡情況

將對數生長期細胞濃度調至1×105個/mL，接種于6孔板中，按照1.3的方法分組，以50 μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用后，繼續培養48 h。收集各組細胞，胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄上清液，用500 μL結合緩沖液重懸細胞，加入5 μL AnnexinV/PITC 混勻，再加入 5 μL PI，混勻，避光、室溫培養15 min后上流式細胞儀檢測，檢測細胞數約為1×104個/組。每組實驗重復3次。

1.6 4，6-聯脒-2-苯基吲哚染色法檢測胰腺癌細胞凋亡形態學變化

將對數生長期細胞濃度調至1×105個/mL，接種在6孔培養板中，按照1.3中的方法分組，以50μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用后，繼續培養48 h。收集各組細胞，采用4，6-聯脒-2-苯基吲哚（DAPI）染色試劑盒檢測細胞凋亡形態學的變化，按試劑盒說明書檢測。DAPI染色結果判定：正常細胞DAPI染色呈藍白色熒光，早期凋亡細胞出現核濃縮，染色加深，晚期凋亡細胞表現為核碎裂呈大小不等的圓形小體，并被細胞膜包繞。

1.7 Western blot檢測凋亡相關蛋白及MAPK/ERK信號通路相關蛋白的表達

將對數生長期細胞濃度調至1×105個/mL，接種在6孔培養板中，按照1.3中的方法分組，以50μmol/L吉西他濱及 0 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 的吡格列酮處理后，繼續培養48 h。收集各組細胞，PBS洗滌2次后，加裂解液，冰上裂解30 min，離心取上清液，以Lowry法進行蛋白定量。取50 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，然后取出凝膠，切膠，并將凝膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，在95 mA電流下轉移3 h，5%脫脂牛奶封閉3 h，室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜。TBST（0.1%Tween20）洗膜3次，加入相應二抗及TBST緩沖液，室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL化學發光法顯色，Quantity One凝膠成像分析軟件拍照并分析各蛋白相對表達量，以β-actin作為內參照。每組實驗重復3次。

1.8 統計學方法

采用SPSS 20.0處理數據。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，若組間差異有統計學意義，進一步的多重比較采用Bonferroni檢驗。以雙側P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 吡格列酮對人胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮組相比，50 μmol/L 吉西他濱組及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮組PANC-1細胞作用24 h、48 h、72 h的OD值均顯著降低（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，PANC-1細胞 OD值越低。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組PANC-1細胞作用24 h、48 h、72 h的OD值均升高（P＜0.05），而 50 μmol/L 吡格列酮組 PANC-1細胞OD值均降低（P＜0.05）。見表1。各組細胞作用48 h與72 h的OD值相差不大，表明細胞作用48 h后，增殖速度趨于平穩，因此本實驗選擇藥物作用時間為48 h進行后續研究。

2.2 吡格列酮對人胰腺癌PANC-1細胞周期的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用于胰腺癌細胞后，G0/G1期細胞比例均顯著升高（P＜0.05），S期細胞比例顯著降低（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，G0/G1期細胞比例越高，S期細胞比例越低，各組G2/M期細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05）。與50 μmol/L 吉西他濱組相比，10 μmol/L 吡格列酮組G0/G1期細胞比例降低（P＜0.05），S期細胞比例升高（P＜0.05），而 20 μmol/L 吡格列酮組 G0/G1期、S期細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05），50 μmol/L 吡格列酮組G0/G1期細胞比例升高（P＜0.05），S期細胞比例降低（P＜0.05）。見圖 1、表 2。

表1 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響（x±s）Tab.1 Effects of pioglitazone on proliferation of human pancreatic cancer PANC-1 cells（x±s）

圖1 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞周期的影響Fig.1 Effect of pioglitazone on cell cycle of pancreatic cancer PANC-1

表2 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞周期的影響（x±s）Tab.2 Effect of pioglitazone on cell cycle of pancreatic cancer PANC-1（x±s）

2.3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響

與 0 μmol/L 吡格列酮組相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L吡格列酮作用胰腺癌細胞后，細胞凋亡率均升高（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，細胞凋亡率越高。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L、20 μmol/L 吡格列酮組細胞凋亡率均降低（P＜0.05），而50 μmol/L 吡格列酮組細胞凋亡率升高（P＜0.05）。見圖 2、表 3。

表3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響（x±s）Tab.3 Effect of pioglitazone on apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells（x±s）

圖2 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of pioglitazone on apoptosis of pancreatic cancer PANC-1 cells

2.4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡形態學的影響

在倒置熒光顯微鏡下用DAPI染色劑檢查細胞凋亡的形態學特征，結果顯示，與0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用胰腺癌細胞后，細胞收縮程度逐漸加重，藍白色熒光逐漸加深，細胞核逐漸碎裂為大小不一的圓形小體，見圖3。

圖3 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡形態學的影響（×400）Fig.3 Effects of pioglitazone on apoptotic morphological of pancreatic cancer PANC-1 cells（×400）

2.5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響

與 0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細胞后，Bcl-2 蛋白表達降低（P＜0.05），而 Bax、caspase-3蛋白表達增強（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，細胞Bcl-2蛋白表達水平越低，Bax、caspase-3蛋白表達水平越高。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組細胞Bcl-2蛋白表達水平升高（P＜0.05），而 Bax、caspase-3 蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；50 μmol/L 吡格列酮組細胞 Bcl-2 蛋白表達水平降低（P＜0.05），Bax、caspase-3蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。見圖 4、表 4。

圖4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.4 Effects of pioglitazone on apoptosis-related protein expression in PANC-1 cells

表4 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞中凋亡相關蛋白表達的影響（x±s）Tab.4 Effect of pioglitazone on apoptosis-related protein expression in PANC-1 cells（x±s）

2.6 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞MAPK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響

與 0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細胞后，p-ERK蛋白表達水平升高（P＜0.05），且吡格列酮濃度越高，p-ERK蛋白表達水平越高，各組ERK蛋白表達水平，差異無統計學意義（P＞0.05）。與50 μmol/L吉西他濱組相比，10 μmol/L吡格列酮組細胞p-ERK 蛋白水平降低（P＜0.05），20 μmol/L 吡格列酮組細胞p-ERK蛋白水平差異無統計學意義（P＞0.05），而50 μmol/L吡格列酮組細胞p-ERK蛋白水平升高（P＜0.05）。見圖 5、表 5。

圖5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞中MAPK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響Fig.5 Effects of pioglitazone on the expression of MAPK/ERK signaling pathway-related proteins in PANC-1 cells

表5 吡格列酮對胰腺癌PANC-1細胞中MAPK/ERK信號通路相關蛋白表達的影響（x±s）Tab.5 Effects of pioglitazone on the expression of MAPK/ERK signaling pathway-related proteins in PANC-1 cells（x±s）

3 討論

胰腺癌起病隱匿、侵襲性強、進展迅速、早期診斷困難、手術切除率低，且對放療、化療敏感性差［6］。5年生存率約為5%，手術切除后中位生存期仍不足2年，大多數患者因腫瘤復發或轉移死亡［7］。目前臨床上尚缺乏有效的治療方案。吡格列酮為噻唑烷二酮類藥物，具有抗氧化、抗炎及改善胰島素抵抗和高血糖等功效［8］，亦有研究表明吡格列酮可抑制成骨細胞增殖，并促進細胞凋亡［9］。只璟泰等［10］研究報道吡格列酮治療甲狀腺癌PAX8-PPARγ融合基因陽性患者可取得一定效果。李莉等［11］研究亦發現吡格列酮能夠明顯促進大鼠胰島素瘤細胞凋亡并抑制其增殖。本研究結果顯示，與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用PANC-1細胞24 h、48 h、72 h后OD值均明顯降低，且吡格列酮濃度越高，PANC-1細胞的OD值越低，與李莉等［11］研究結果相似。提示吡格列酮能夠抑制胰腺癌細胞增殖，且吡格列酮濃度越高，其對胰腺癌細胞增殖抑制越明顯，可能具有抗腫瘤作用。進一步采用流式細胞術檢測胰腺癌細胞周期，發現與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱、10μmol/L、20μmol/L、50μmol/L吡格列酮作用后G0/G1期細胞比例均升高，而S期細胞比例降低，說明吡格列酮作用胰腺癌細胞后，大部分細胞被阻滯在G0期、G1期，從而抑制細胞增殖。

正常條件下，細胞的凋亡與增殖維持著動態平衡。但在腫瘤組織中，這種平衡被打破，因此在腫瘤治療中，誘導癌細胞凋亡是關鍵［12］。研究表明吡格列酮可能通過改變細胞膜電位，促進急性胰腺炎細胞凋亡［13］。本研究結果顯示，與0 μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用后胰腺癌細胞凋亡率升高，且吡格列酮濃度越高，胰腺癌細胞凋亡率越高，提示吡格列酮可能促進胰腺癌細胞凋亡。王云等［14］研究亦表明吡格列酮能明顯抑制肺癌細胞增殖，促進細胞凋亡。DAPI作為一種熒光染料，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結合，進而發揮標記作用，在顯微鏡下可看到顯藍白色熒光的細胞，根據熒光的強度及細胞質、細胞核的形態可檢測出細胞凋亡情況。因此，本研究采用DAPI細胞核染色觀察細胞凋亡的形態學特征，發現與0 μmol/L吡格列酮作用相比，50 μmol/L吉西他濱及10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用胰腺癌細胞后，細胞收縮程度逐漸加重，藍白色熒光亦逐漸加深，細胞核逐漸碎裂為大小不一的圓形小體。說明胰腺癌DANC-1細胞在不同濃度吡格列酮作用下，細胞凋亡程度逐漸加重。

為進一步探索胰腺癌細胞凋亡的分子機制，本研究檢測凋亡相關基因Bcl-2、Bax、caspase-3等的表達情況。其中Bcl-2是常見促凋亡基因；Bax基因具有抗Bcl-2蛋白、誘導細胞凋亡的作用［15-16］；caspase-3是細胞凋亡過程中最重要的剪切酶，在細胞凋亡中具有重要的作用［17］。本研究Western blot實驗結果顯示，與0μmol/L吡格列酮相比，50μmol/L吉西他濱及10μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L 吡格列酮作用 PANC-1 細胞后Bcl-2蛋白表達水平均降低，而Bax、caspase-3表達均增強，且吡格列酮作用濃度越高Bcl-2蛋白表達水平越低，Bax、caspase-3表達水平越高，提示吡格列酮作用后可能通過抑制抗凋亡蛋白表達，增強促凋亡蛋白表達，從而促進腫瘤細胞凋亡。MAPK/ERK是細胞外調節蛋白激酶信號，亦是調節細胞凋亡的重要通路［18］。其中p-ERK蛋白水平是反映MAPK/ERK信號通路激活情況的重要指標［19］。YI等［20］研究表明吡格列酮能夠劑量依賴性地抑制人子宮平滑肌肉瘤SK-UT-1細胞p-ERK蛋白的表達。本研究結果顯示，與0μmol/L吡格列酮相比，50 μmol/L 吉西他濱及 10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L吡格列酮作用后 PANC-1細胞 p-ERK蛋白表達水平降低，且吡格列酮濃度越高，p-ERK蛋白表達水平越低，提示MAPK/ERK信號通路活化可能參與胰腺癌PANC-1細胞凋亡過程。

綜上所述，吡格列酮能抑制胰腺癌細胞PANC-1增殖，并誘導其凋亡，吡格列酮可能通過調控凋亡相關蛋白及MAPK/ERK通路而誘導胰腺癌細胞PANC-1凋亡，吡格列酮調控胰腺癌細胞增殖與凋亡的機制十分復雜，具體調控機制仍需進一步探索。