雙波長HPLC法測定止癢地霜中地塞米松和羥苯乙酯的含量

郝 哲，邱會蘋，王麗軍，劉 棟，宋艷麗，王偉勤，屈 俊

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九八八醫院制劑室，河南 鄭州 450042)

止癢地霜系本院自制制劑，主要用于過敏性皮炎，療效頗佳。該制劑處方以地塞米松磷酸鈉為主藥，以羥苯乙酯為抑菌劑。地塞米松磷酸鈉是一種常用激素類藥，連續攝入過多易導致機體激素失衡而引起一系列癥狀，攝入不足則達不到理想治療效果[1]，因此，有必要控制其含量。羥苯乙酯為尼泊金酯類防腐劑，具有廣譜抑菌作用，常用于食品、藥品和化妝品中[2-4]。人用藥物注冊技術要求國際協調會議(ICH)明確提出應制訂抑菌劑含量測定方法[5]，藥物制劑中抑菌劑用量不足，達不到有效抑菌濃度；用量過大，具有一定毒性，易引起不良反應[6]。近年來，檢測制劑中羥苯乙酯的含量已越來越引起人們的重視[7-14]。本試驗采用一種方法同時測定止癢地霜中主藥及抑菌劑兩種成分的含量，方法簡便，快速，可為其質量標準的制定提供一定的科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10A高效液相色譜儀，配置SPD-10A 紫外檢測器(日本島津公司)，LC-solution Lite色譜工作站；BT-125D型電子天平(賽多利斯有限公司)；AS3120A 型超聲波清洗器(天津Auto-science公司)。

1.2 試藥

地塞米松磷酸酯對照品(純度98.5%，批號：101116-201001，中國食品藥品檢定研究院)；羥苯乙酯對照品(純度99.9%，批號：100847-201604，中國食品藥品檢定研究院)。

止癢地霜3批(批號：181020，181022，181024)和陰性樣品均為本院自制；水為自制蒸餾水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Wondasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；以三乙胺溶液(取三乙胺7.5 ml，加水稀釋至1 000 ml，用磷酸調節pH 值至3.0 ± 0.05 )-甲醇-乙腈(52 ：43 ：5)為流動相；檢測波長為256 nm和242 nm；柱溫40 ℃，流速為1 ml/min；進樣量為10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液

分別精密稱取羥苯乙酯對照品10.72 mg、地塞米松磷酸酯對照品10.58 mg置于50 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。再精密量取2 ml 置10 ml量瓶中，加流動相溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液

取本品4 g (約相當于地塞米松磷酸鈉4 mg)，精密稱定，置燒杯中，加甲醇約30 ml，50 ℃水浴保溫，超聲15 min，移至50 ml量瓶中，放至室溫，用甲醇稀釋至刻度，置冰浴中放置1 h，濾過，棄去初濾液，取續濾液5 ml至10 ml量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，過0.22μm微孔濾膜，即得。

2.2.3陰性對照品溶液

根據處方中藥物的比例，按相關工藝制備不含對應成分的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照品溶液。

2.2.4系統適用性試驗

分別取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl注入液相色譜儀，照上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。其中測定地塞米松磷酸鈉的含量時，因以地塞米松磷酸酯為對照品，按外標法計算應以地塞米松磷酸酯的峰面積乘以1.0931，即得。結果見圖1。由圖可知，各主成分分離度好，陰性對照品在相應位置上無吸收，表明陰性無干擾。

圖1 止癢地霜HPLC圖 A.混合對照品(256 nm)；B.供試品(256 nm)；C.陰性對照品(256 nm)；D.混合對照品(242 nm)；E.供試品(242 nm)；F.陰性對照品(242 nm)；1.羥苯乙酯；2.地塞米松磷酸酯

2.2.5線性關系考察

分別精密吸取“2.2.1”項下對照品儲備溶液1、1.5、2、2.5、3 ml置10 ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，吸取10 μl注入色譜儀，按上述色譜條件測定，以對照品的質量濃度(X,μg/ml)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，羥苯乙酯、地塞米松磷酸酯的回歸方程分別為Y=57653X-440.8，r=1.000 0(n=5)和Y=18524X+321.4，r=0.9999(n=5)。結果表明，羥苯乙酯、地塞米松磷酸酯分別在21.42～64.26 μg/ml和20.84～62.53 μg/ml范圍內有良好的線性關系。

2.2.6精密度試驗

吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液重復進樣6次，每次進樣10 μl，測定其峰面積，結果羥苯乙酯、地塞米松磷酸酯RSD值分別為0.94%、1.00%，表明儀器精密度良好。

2.2.7重復性試驗

精密稱取6份樣品(批號：181020)各4 g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，照“2.1”項下色譜條件進行測定，結果羥苯乙酯含量為1.04 mg/g; 地塞米松磷酸鈉含量為1.02 mg/g，其 RSD值分別為1.00%、0.95%，表明該方法重復性良好。

2.2.8穩定性試驗

取供試品溶液適量，分別于0、2、4、8、12 h進樣10μl，分別測定其峰面積，結果羥苯乙酯、地塞米松磷酸鈉的含量的RSD值分別為1.00%、1.01%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.2.9加樣回收率試驗

精密稱取已知羥苯乙酯、地塞米松磷酸鈉含量的樣品(批號：181020)9份，其中羥苯乙酯含量為1.04 mg/g; 地塞米松磷酸鈉含量為1.02 mg/g。按照樣品中各成分含有量的80%，100%，120%分別精密加入相應對照品(羥苯乙酯對照品濃度為0.418 0 mg/ml; 地塞米松磷酸酯濃度為0.372 3 mg/ml)各3份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液并照上述色譜條件測定，分別計算平均回收率，結果見表1。

表1 止癢地霜加樣回收率試驗結果(n=9)

注：做地塞米松磷酸鈉回收率時，加入的是地塞米松磷酸酯對照品，表中折算為地塞米松磷酸鈉的含量

2.2.10樣品含量測定

分別取3批樣品，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依“2.1”項下方法進行含量測定，以外標法計算含量，結果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

試驗曾比較了甲醇、乙醇兩種提取溶劑，結果二者提取的樣品冰浴后，基質均無明顯析出，但甲醇提取的樣品二者含量均略高且雜質峰面積較小，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.2 冰浴時間考察

試驗曾考察了冰浴1 h與2 h，結果二者含量基本一致，故選擇冰浴1 h 后，趁冷過濾。

3.3 流動相選擇

本試驗曾嘗試用甲醇-1%冰醋酸溶液(65∶35)[3]和(40：60)體系、甲醇-0.03 mol/L磷酸二氫鉀溶液(0.1%三乙胺，用50%磷酸調pH 3.0 ± 0.03)(60∶40)[5]及甲醇-乙腈-三乙胺溶液體系[15]等。結果發現甲醇-乙腈-三乙胺溶液體系分離效果最好，但按照《中國藥典》[15]中比例，二者出峰較慢，適當調整流動相比例后，二者峰形尖銳，出峰時間提前10 min，且均達到基線分離，故選擇該體系。

表2 止癢地霜含量測定結果(n=3)

3.4 檢測波長的選擇

將羥苯乙酯和地塞米松磷酸酯兩種對照品儲備液用流動相稀釋后在200～400 nm波長范圍內進行掃描，結果羥苯乙酯的最大吸收波長在256 nm，地塞米松磷酸酯的最大吸收波長在242 nm。羥苯乙酯在242 nm處的峰面積與256 nm處的峰面積比值為0.57，峰高比值為0.57，地塞米松磷酸酯在256 nm處的峰面積與242 nm處的峰面積比值為0.73，峰高比值為0.74，兩組分在兩個波長下，峰面積及峰高差異均較大。羥苯乙酯在256nm處峰形尖銳且對稱，響應值高；而地塞米松磷酸酯在242nm處的峰形較好且響應值較高，故采用雙波長檢測法，分別在其最大吸收波長處測定各組分的含量，檢測靈敏度更高，受基線噪音干擾更小，誤差更小，定量更準確。

3.5 柱溫的考察

本試驗曾對柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃進行了考察，結果柱溫為40 ℃時，樣品峰形對稱且尖銳，重復性好，故選擇柱溫為40 ℃。

3.6 提取時間考察

分別對樣品超聲提取15、25、35 min；結果三者提取結果基本一致，表明提取15 min足以將樣品中有效成分全部溶出，故選擇提取15 min。

3.7 含量限度確定

本處方中地塞米松磷酸鈉和羥苯乙酯含量均為1 mg/g，取其標示量的90.0%～110.0%為含量限度，即得地塞米松磷酸鈉和羥苯乙酯的含量限度均為0.9 mg/g～1.1 mg/g，本實驗所測值均在此范圍內。