復方黃連灌腸液的總黃酮測定方法研究

倪曉霞，王慶芬，劉曉玲，葉財發

(中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇九醫院/廈門大學附屬東南醫院制劑科，福建 漳州 363000)

復方黃連灌腸液是按我院消化內科協定處方制成的復方中藥灌腸液，用于治療潰瘍性結腸炎，臨床效果顯著。復方黃連灌腸液處方由黃連、白頭翁、黃芪、甘草、山藥等13味中藥組成，方中多味中藥均含有黃酮類物質，本研究擬通過研究復方黃連灌腸液中總黃酮含量測定方法，為建立其質量控制標準奠定基礎。

總黃酮含量測定常用方法有高效液相色譜法[1]、毛細管電泳法[2]及紫外可見分光光度法[3-11]等，其中紫外可見分光光度法包括直接測定法和比色法。近年來，金屬離子絡合法[5-11]已成為總黃酮含量測定應用最廣泛的方法[8]，其原理是在酸性或堿性條件下，金屬離子與黃酮發生絡合反應，生成不同顏色的金屬螯合物，再在紫外或可見光區用比色法測定其含量[8]，常用的顯色方法有HCl-Mg法、氯化鋁-醋酸鈉顯色法(AlCl3-CH3COONa法)、硝酸鋁顯色法[NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法]。由于HCl-Mg法反應過程劇烈，反應液中含有的乙醇使反應結果的重復性難以控制，且該法對多數異黃酮類成分不顯色[8]，因此本文沒有采納此法。復方黃連灌腸液中總黃酮測定方法未見報道，筆者分別以槲皮素、蘆丁及橙皮苷為對照品，對直接測定法、AlCl3-CH3COONa法和NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法等3種顯色方法進行考察，選擇并優化總黃酮含量測定方法，建立適用于復方黃連灌腸液中總黃酮含量測定的方法。

1 儀器與試藥

槲皮素對照品(批號：117-39-5)、蘆丁對照品(批號：153-18-4)、橙皮苷對照品(批號：520-26-3)，均購自貴州迪大生物科技有限責任公司；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氯化鋁、醋酸鈉(西隴化工股份有限公司)；95%乙醇(上?；瘜W試劑總廠)；試劑均為分析純；復方黃連灌腸液(本院自制，批號：20181206、20181207、20181208)。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

2.1.1蘆丁對照品溶液

精密稱取蘆丁對照品0.031 1 g，加70%乙醇適量，水浴加熱溶解，放置冷卻至室溫，定容至50 ml，搖勻，即得濃度為0.622 mg/ml的對照品儲備液。精密量取儲備液10 ml，用70%乙醇定容至100 ml，搖勻，即得濃度為62.2 μg/ml的對照品溶液。

2.1.2槲皮素對照品溶液

精密稱取槲皮素對照品0.0389g，加70%乙醇適量，溶解并定容至25ml，搖勻，即得濃度為1.556mg/ml的對照品溶液。

2.1.3橙皮苷對照品溶液

精密稱取橙皮苷對照品0.0165g，加70%乙醇適量，水浴加熱溶解，放置冷卻至室溫，定容至25ml，搖勻，即得濃度為0.660mg/ml的對照品溶液。

根據以上總結，同時結合安徽新華學院信息工程學院的共享資源課程建設實際情況，對資源共享課程建設從建設目標和具體做法上提出以下建設方法的探討。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取復方黃連灌腸液2.0 ml，置50 ml容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度搖勻，4 000 r/min，離心15 min，取上清液，即得供試品溶液，備用。

2.3 顯色方法與對照品考察

2.3.1直接測定法

精密量取對照品溶液和供試品溶液(批號：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻。以60%乙醇為參比，在200～800 nm波長范圍內掃描，記錄光譜圖。結果蘆丁、槲皮素、橙皮苷對照品溶液分別在375.9、361.3、285.8nm處有最大吸收；供試品溶液在330.8nm、279.2 nm有強吸收，見圖1A。

2.3.2AlCl3-CH3COONa顯色法

分別精密量取對照品溶液和供試品溶液(批號：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，依次加入0.1 mol/L AlCl3溶液3 ml，1 mol/L NaAC溶液4 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，以供試液不加顯色劑為參比，在200～800 nm波長范圍內掃描，記錄光譜圖。結果槲蘆丁、槲皮素、橙皮苷對照品溶液分別在418.5、436.6、287.2 nm處有最大吸收；供試品溶液在331.8～277.3 nm波長范圍內，吸光度隨波長變小而增強，在277.3 nm處有最大吸收，見圖1B。

2.3.3NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法

分別精密量取對照品溶液和供試品溶液(批號：20181206)1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，在200～800 nm波長范圍內掃描，記錄光譜圖。結果槲蘆丁、槲皮素、橙皮苷對照品溶液及供試品溶液均在371.0 nm處有最大吸收，見圖1C。

圖1 顯色方法與對照品考察圖譜 A.直接測定法；B.AlCl3-CH3COONa顯色法；C.NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法；1.供試品溶液；2.蘆丁對照品溶液；3.槲皮素對照品溶液；4.橙皮苷對照品溶液

綜合比較以上3種顯色系統，采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色系統時，3種對照品溶液的最大吸收波長均能與供試品溶液的最大吸收波長一致，max=371 nm。故筆者最終采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色法，以蘆丁為對照品，在371 nm處測定復方黃連灌腸液中總黃酮含量，并對顯色條件進行優化。

2.4 供試液本體干擾考察

精密量取供試品溶液(批號：20181206)1.0 ml，置25 ml容量瓶中，加60%乙醇至刻度，以60%乙醇作為參比，于200～800 nm范圍掃描，記錄光譜圖。圖譜顯示在250～400 nm范圍內，不加顯色劑的供試品溶液有一定吸收，并且在371 nm波長附近存在吸收波谷。提示：供試品溶液對總黃酮含量測定存在一定的干擾，但選擇371 nm作為總黃酮含量測定波長時，影響最小，故供試品溶液中總黃酮含量測定以不加顯色劑的供試品溶液作為參比(見圖2)。

2.5 顯色條件優化

2.5.1顯色時間的考察

(1)加入NaNO2后放置時間對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置2、4、6、8、10 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度。圖譜提示，加入NaNO2后放置時間對供試品溶液的吸光度影響不大；加入后6 min時，蘆丁對照品溶液有最大吸收，見圖3A。(2)加入Al(NO3)3后放置時間對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻，分別靜置2、4、5、6、8、10 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度。圖譜提示，加入Al(NO3)3后2～6 min，供試品溶液的吸光度隨放置時間增大，而后隨時間延長，吸光度趨于穩定；加入Al(NO3)3后，蘆丁對照品溶液的吸光度隨放置時間先增大，5min后開始降低，見圖3B。(3)加入NaOH后放置時間對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻，分別靜置3、5、10、15、20、25 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度，記錄結果。圖譜提示，加入NaOH 10 min時，供試品溶液與蘆丁對照品溶液均有最大吸收，見圖3C。

2.5.2顯色劑用量的考察

(1)NaNO2溶液用量對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，分別加5%亞硝酸鈉溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 、2.5、3.0 ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10 ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度，記錄結果。圖譜提示，NaNO2溶液用量由0.25 ml增至1.5 ml時，供試品溶液與蘆丁對照品溶液吸光度增大，而后隨用量增大吸光度基本趨于穩定，見圖4A。(2)Al(NO3)3溶液用量對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置6 min，分別繼續加10%硝酸鋁溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液10ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，分別以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度，記錄結果。圖譜提示，Al(NO3)3溶液用量為0.5～1.5ml，蘆丁對照品溶液吸光度趨于穩定，而后隨用量增大而降低；Al(NO3)3溶液用量為0.5～1.0 ml，供試品溶液吸光度趨于穩定，而后隨用量增大而降低，見圖4B。(3)NaOH溶液用量對吸光度的影響：分別精密量取蘆丁對照品溶液和供試品溶液1.0 ml置于25 ml容量瓶中，加5%亞硝酸鈉溶液1 ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置6 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液3、5、7.5、10、12.5、15ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置15 min，分別以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度，記錄結果。圖譜提示，NaOH溶液用量為7.5 ml，蘆丁對照品溶液吸光度最大，而后隨用量增大而降低；NaOH溶液用量為5～10ml，供試品溶液吸光度趨于穩定，而后隨用量增大而降低，見圖4C。

圖3 顯色時間考察圖譜 A.加入NaNO2后放置時間對吸光度的影響；B.加入Al(NO3) 3后放置時間對吸光度的影響；C.加入NaOH后放置時間對吸光度的影響；a.供試品溶液；b.蘆丁對照品溶液

圖4 顯色劑用量考察圖譜 A.NaNO2溶液用量對吸光度的影響；B.Al(NO3) 3溶液用量對吸光度的影響；C.NaOH溶液用量對吸光度的影響；a.供試品溶液；b.蘆丁對照品溶液

2.5.3顯色條件確定

結合上述實驗結果，綜合考慮實驗過程的高效性與經濟效益，最終確定NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色體系的條件為加5%亞硝酸鈉溶液1.5ml，搖勻，分別靜置6 min，繼續加10%硝酸鋁溶液1 ml，搖勻靜置5 min，最后加入4%氫氧化鈉溶液7.5ml，用60%乙醇稀釋至刻度，搖勻靜置10 min，以供試液不加顯色劑為參比，于371 nm處測定吸光度。

2.6 提取溶劑濃度考察

精密量取供試液(20181206)5.0ml，分別用水及30%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液和無水乙醇定容至50ml，4 000 r/min，離心15min，取上清液備用。分別精密量取上述各上清液1.0ml，按“2.5.3”項下顯色條件，于371nm處測定吸光度，記錄結果。圖譜提示，當提取溶劑中乙醇濃度為70%時，供試品溶液有最大吸光度(見圖4C)。

圖5 提取溶劑乙醇濃度對吸光度的影響

2.7 方法學考察

2.7.1線性與回歸方程

精密量取蘆丁對照溶液(62.2 μg/ml)1、2、2.5、3、4、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，按“2.5.3”項下顯色條件，制備系列濃度對照品溶液，以同法制備參比溶液，于371 nm處測定吸光度，以濃度(g/L)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。計算得回歸方程為：Y=7.63551X-0.02706 (r=0.9995)，表明蘆丁對照品濃度在2.488～12.44 μg/ml范圍內與吸光度之間呈現良好的線性關系。

2.7.2精密度試驗

精密量取蘆丁對照溶液1.0 ml，6份，置于25 ml量瓶中，按“2.5.3”項下顯色條件于371 nm處測定吸光度，以吸光度計算RSD%(n=6)，結果RSD為0.77 %，表明儀器的精密度良好。

2.7.3重復性試驗

取同一批復方黃連灌腸液(批號：20181212)6份，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液，精密量取供試品溶液1.0 ml，按“2.5.3”項下顯色條件，于371 nm測定吸光度并計算總黃酮含量。結果供試品溶液總黃酮的平均含量為15.41 mg/ml，RSD為0.32 %，表明該方法重復性良好。

2.7.4加樣回收率試驗

精密量取供試品溶液(批號：20181212，總黃酮含量為0.308 8 mg/ml)0.5 ml置于25 ml容量瓶中，分別加入蘆丁對照品溶液(0.622 mg/ml)0.25 ml，按“2.5.3”項下顯色條件，于371 nm波長處測定吸光度并計算總黃酮含量。結果得平均回收率為100.43%，RSD為1.328%(n=6)，見表1。

2.8 復方黃連灌腸液總黃酮含量測定

取復方黃連灌腸液按“2.2”項下方法制備供試品溶液3批(批號：20181206、20181207、20181212)，分別精密量取供試品溶液0.5 ml，按“2.5.3”項下顯色條件，依次添加各試劑，于371 nm波長處測定吸光度并計算總黃酮含量，結果見表2。

表2 復方黃連灌腸液總黃酮含量測定結果

3 討論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機化合物，泛指具有2-苯基色原酮結構的化合物，來源不同的黃酮類物質母核上結合的不同的機能基團，包括酚羥基、各種糖苷等，因此其數量列為天然酚類化合物之首[12]。黃酮類化合物的特殊母核結構存在兩個主要的紫外吸收帶：峰帶I(300～400 nm)和峰帶II(220～280 nm) ，但一般藥材或飲片提取物中存在多種干擾物質，對其含量測定產生較大干擾。NaNO2-Al( NO3)3-NaOH顯色法的原理是在堿性條件下，黃酮類化合物中的3-OH、4-OH、5-OH、4-CO或鄰二位酚羥基等與Al3+進行絡合反應，生成紅色絡合物，并且一定濃度范圍內，其濃度與吸光度符合比爾定律。

目前，已有文獻報道采用NaNO2-Al( NO3)3-NaOH顯色法測定總黃酮含量[4-12]，而該方法用于復方黃連灌腸液中總黃酮含量測定尚未見報道，故筆者參考該顯色法用于測量黃連灌腸液中總黃酮含量，并對該具體顯色時間和顯色劑用量進行考察，最終確定1.5 ml 5% NaNO2溶液(6 min)、1.0 ml 10% Al( NO3)3溶液(5 min)和7.5 ml 4% NaOH溶液(10 min)為最佳顯色條件。通過對該方法進行精密度、重復性及加樣回收率等方面考察，結果表明，該方法適用于復方黃連灌腸液中總黃酮含量測定，具有簡便快速、準確可靠等優點。

文中測定的3批復方黃連灌腸液中總黃酮含量波動從11%到15%，含量相差較大，其原因可能與第三批制劑(批號為20181212)啟用新一批次原料藥材有關，由于中藥飲品質量良莠不齊，可能造成不同批次制劑成品之間總黃酮含量相差較大，建議加強該制劑相關原料藥材的質量控制；結合制劑提取、澄清工藝考察結果與原料藥材的質量標準范圍，進行復方黃連灌腸液質量標準研究，合理設置復方黃連灌腸液中總黃酮含量的限度值，以保證臨床用藥安全有效。