真菌Chaetomium sp.的次級代謝產物研究

孟 慧，許 勇

(中國人民解放軍海軍905醫(yī)院設備科，上海，200052)

以抗生素為代表的微生物天然產物因具有重要生物活性一直是人類治療疾病的主要藥物，如抗感染藥物青霉素(penicillin)和紅霉素(erythromycin)、抗腫瘤藥物博來霉素(bleomycin)和埃博霉素(epothilone)、抗寄生蟲藥物阿維菌素(avemectin)和免疫抑制劑環(huán)孢素(cyclosporin)等[1]。迄今，僅從微生物的次生代謝產物中就發(fā)現(xiàn)了16000余種活性物質和數(shù)萬種衍生物和結構修飾物，先后推向臨床的微生物藥物約有200余種。海洋特殊的生存環(huán)境，如高鹽、高壓、低溫和寡營養(yǎng)，使生活在其中的微生物具備特殊的遺傳物質，在長期進化過程中獲得產生結構新穎次級代謝產物的能力，因此，海洋微生物被看作是下一代新藥研發(fā)的藍色寶庫[2-3]。近年來，從我國近海的海洋微生物中發(fā)現(xiàn)了大量活性顯著、結構新穎的天然產物，成為藥物研發(fā)領域的新熱點[4-5]。

鑒于海洋微生物產生新穎天然產物的巨大潛力，本研究對來源于海洋近海的海洋真菌開展次級代謝產物研究，運用正、反相硅膠柱色譜、凝膠柱色譜以及高效液相色譜(HPLC)等分離純化技術，對分離自海南三亞附近海域的共附生真菌Chaetomiumsp.進行次級代謝產物的研究。毛殼屬(Chaetomium)是腐生子囊菌中數(shù)量最多的類群之一，至今共鑒定了81種，是一類重要的資源真菌，呈世界性分布[6]。Ahmed課題組在對爵床科鴨嘴花(JusticiaadhatodaL.)的內生真菌研究中發(fā)現(xiàn)Chaetomiumsp.NF15的提取物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和白色念珠菌(Candidaalbicans)都有顯著的抗菌活性[7]。譚仁祥課題組從沙參(Adenophoraaxilliflora)的內生真菌Chaetomiumsp.IFB-E015.中分離得到新穎的生物堿chaetominine，其對白血病K562細胞和結腸癌SW116細胞具有強力的細胞毒活性[8]。本研究從Chaetomiumsp.中分離純化得到4個十元環(huán)內酯類化合物(nonanolide)和1個倍半萜類化合物，并運用質譜、核磁共振等現(xiàn)代波譜技術結合文獻報道完成了結構鑒定(見圖1)。

圖1 從Chaetomium sp.中分離鑒定的5個化合物結構式

1 儀器、試劑與材料

1.1 儀器與試劑

HZQ-F280型全溫震蕩培養(yǎng)箱(中國，常州金壇精達儀器制造有限公司)；LDZH-200KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(中國，上海申安醫(yī)療器械有限公司)；Bruker Varian Inova-600、Avance-500核磁共振儀(德國，Bruker公司)；Agilent 1100高效液相色譜儀配有RID檢測器(美國，Agilent公司)和Zorbax 300-C18柱(250 mm × 9.4 mm，5 μm，美國，Agilent公司)；Sephadex LH-20凝膠(美國，Amersham Pharmacia Biotech公司)；TLC薄層板、柱色譜(中國，煙臺黃務硅膠開發(fā)實驗廠)；開放柱色譜所用溶劑甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚和丙酮均為分析純(中國，國藥集團上海化學試劑公司)，HPLC所用試劑為色譜純甲醇(中國，上海阿達瑪斯有限公司)和水(中國，娃哈哈集團有限公司)。

1.2 樣品

實驗所用菌株由本實驗室從海南三亞沿海的海底沉積物中分離得到，并鑒定為Chaetomiumsp.，菌株編號HN1186。將菌株接種到培養(yǎng)基上(50 g生物麥芽糖，15 g瓊脂，800 ml人工海水，pH 7.4)，培養(yǎng)箱溫度28℃，固體培養(yǎng)30 d，共培養(yǎng)480塊。

2 提取與分離

共附生真菌Chaetomiumsp.(編號HN1186)菌株用含5%生物麥芽提取物的Biomalt固體瓊脂培養(yǎng)基室溫發(fā)酵30 d，培養(yǎng)物用乙酸乙酯提取(3.0 L×5次)，合并提取液，濃縮得總浸膏2.50 g。將總浸膏進行正相硅膠柱色譜分離，依次用石油醚/丙酮(100∶0,50∶1,20∶1,10∶1,5∶1,4∶1,3∶1,2∶1,1∶1,0∶1)和甲醇系統(tǒng)作為洗脫劑進行梯度洗脫，TLC點板合并得到Fr.A～ K共11個部分。對Fr.E進行Sephadex LH-20凝膠柱色譜[CH2Cl2∶MeOH=(2∶1)]，TLC點板合并得到Fr.E1～ E9共9個組分，對Fr.E5進行ODS柱色譜分離(20%～100%甲醇/水)和半制備HPLC(40%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物2 (4.0 mg)和5 (3.2 mg)。對Fr.E7進行半制備HPLC(35%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物1 (1.8 mg)。對Fr.H進行Sephadex LH-20凝膠柱色譜(CH2Cl2：MeOH=2:1)，TLC點板合并得到Fr.H1～ H7共7個組分，對Fr.H2進行半制備HPLC(25%甲醇/水，2.0 ml/min)純化，得到單體化合物3 (1.5 mg)和4 (1.8 mg)。

3 結構鑒定

所有化合物進行MS譜和1H、13C NMR譜的波譜數(shù)據(jù)采集，經過波譜解析和與參考文獻比對，完成了結構鑒定。

化合物1：ESI-MS：m/z [M+H]+215.08， 分子式為C10H14O5。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.88(1H，dd，J=14.5，6.8，H-2a)，2.41(1H，dd，J=14.5，10.0 Hz，H-2b)，3.51(1H，dd，J=14.5，10.0 Hz，H-3)，2.80(1H，dd，J=7.0，1.7 Hz，H-4)，2.63(1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-5)，2.56(1H，dd，J=8.2，4.4 Hz，H-6)，3.02(1H，dt，J=8.2，4.0 Hz，H-7)，2.25(1H，dd，J=14.9，4.8 Hz，H-8a)，1.70(1H，dd，J=14.9，4.1 Hz，H-8b)，4.89(1H，m，H-9)，1.30(3H，d，J=6.4 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：172.6(C-1)，44.0(C-2)，72.6(C-3)，60.2(C-4)，60.5(C-5)，58.9(C-6)，55.2(C-7)，38.8(C-8)，73.1(C-9)，23.9(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]的botryolide A基本一致。

化合物2：ESI-MS：m/z [M+H]+199.09，分子式為C10H14O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.67(1H,dd，J=10.3，3.6 Hz，H-2a)，2.44(1H，dd，J=10.5，10.0 Hz，H-2b)，4.89(1H，m，H-3)，5.72(1H，ddd，J=11.5，8.1，1.8 Hz，H-4)，5.47(1H，ddd，J=11.5，5.4，1.0 Hz，H-5)，3.48(1H，m，H-6)，3.00(1H，m，H-7)，2.18(1H，m，H-8a)，1.25(1H，m，H-8b)，5.30(1H，m，H-9)，1.29(3H，d，J=6.2 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：170.2(C-1)，43.7(C-2)，67.9(C-3)，128.1(C-4)，135.9(C-5)，57.2(C-6)，53.5(C-7)，38.2(C-8)，67.9(C-9)，20.6(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]的botryolide B基本一致。

化合物3：ESI-MS： m/z [M+H]+217.10，分子式為C10H16O5。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.67(1H，dd，J=16.4，2.4，H-2a)，2.28(1H，m，H-2b)，4.12(1H，m，H-3)，2.42(1H，m，H-4a)，1.46(1H，m，H-4b)，2.46(1H，m，H-5a)，2.25(1H，m，H-5b)，4.12(1H，m，H-7)，2.29(1H，m，H-8a)，1.94(1H，m，H-8b)，4.99(1H，m，H-9)，1.20(3H，d，J=6.4Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：170.3(C-1)，42.5(C-2)，64.1(C-3)，30.9(C-4)，35.1(C-5)，211.0(C-6)，74.4(C-7)，39.5(C-8)，69.2(C-9)，19.8(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]的botryolide D基本一致。

化合物4：ESI-MS：m/z [M+H]+199.06，分子式為C10H14O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：2.58(2H，m，H-2)，4.99(1H，m，H-3)，5.86(1H，d，J=6.1 Hz，H-4)，5.76(1H，d，J=6.1 Hz，H-5)，4.85(1H，s，H-6)，3.75(1H，m，H-7)，1.82(1H，m，H-8a)，1.57(1H，m，H-8b)，4.95(1H，m，H-9)，1.17(3H，d，J=6.4 Hz，H-9Me)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：171.3(C-1)，39.5(C-2)，81.2(C-3)，127.3(C-4)，131.3(C-5)，92.2(C-6)，72.9(C-7)，41.9(C-8)，71.0(C-9)，21.3(C-9Me)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]的decarestrictine I基本一致。

化合物5：ESI-MS：m/z [M+H]+265.14，分子式為C15H20O4。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δH：3.91(1H，d，J=14.5 Hz，H-2)，2.01(1H，ddd，J=13.6,5.6,1.8 Hz，H-3a)，2.68(1H，dd，J=14.0,4.0 Hz，H-3b)，4.30(1H，brs，H-4)，2.88(1H，d，J=9.2 Hz，H-7a)，2.28(1H，d，J=9.2 Hz，H-7b)，6.45(1H，d，J=5.7 Hz，H-10)，3.81(1H，J=5.7 Hz，H-11)，3.02(1H，d，J=8.1 Hz，H-13a)，2.83(1H，d，J=8.1 Hz，H-13b)，0.79 (3H，s，H-14)，0.97 (3H，s，H-15)，1.81 (3H，s，H-16)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δC：79.3(C-2)，40.3(C-3)，73.3(C-4)，49.3(C-5)，43.3(C-6)，42.2(C-7)，198.9(C-8)，138.3(C-9)，137.4(C-10)，69.9(C-11)，65.7(C-12)，47.3(C-13)，6.0(C-14)，18.4(C-15)，15.5(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]的trichothecolone基本一致。

4 討論

筆者對海洋真菌Chaetomiumsp.的次級代謝產物進行研究，首次從該真菌中發(fā)現(xiàn)5個化合物，從結構上看，5個化合物分別屬于十元環(huán)內酯類和倍半萜類。botryolides A，B，D和decarestrictine I均為十元環(huán)內酯(nonanolide)，屬于典型的真菌來源的聚酮類化合物，由真菌中的高度還原型聚酮合成酶負責合成。該類化合物在自然界廣泛分布，具有細胞毒性、抗菌、抗真菌和除草等廣泛的生物活性[12]。botryolides A，B和D最早分離自真菌Botryotrichumsp.(NRRL 38180)，化學結構和絕對構型由波譜解析方法和改良Mosher法確定，botryolides B的絕對構型還經過化學全合成實驗驗證[10]。前期活性評價表明，該3個化合物在100 μg/板的濃度下對人體致病菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌以及對農作物致病真菌黃曲霉和輪枝樣鐮刀菌均無活性。decarestrictine I屬于結構特殊的十元環(huán)內酯，分子中包括一個含(Z)式雙鍵的二氫呋喃環(huán)，受到化學合成學家的關注[10,13-14]。trichothecolone為倍半萜類化合物，屬于單端孢霉烯(trichothecene)類真菌毒素，該類毒素可以由曲霉菌、青霉菌和鐮刀霉菌等真菌產生，在自然界廣泛存在，是污染糧食的主要毒素，能引起人類食物中毒，主要癥狀表現(xiàn)為惡心、嘔吐和厭食，主要靶器官是肝臟和腎臟[15]。trichothecolone細胞毒活性篩選表明，它對人口腔表皮樣癌(KB)，人皮膚黑色素瘤(SK-MEL 30)，人肺癌(A-459)和人乳腺癌(MCF-7)細胞株具有明顯活性，IC50值分別為10.6，8.6，7.1和10.6μg/ml[15]。海洋真菌Chaetomiumsp.中獲得的十元環(huán)內酯類和倍半萜類，在其他種屬的真菌也見有報道，提示負責這些次級代謝產物的生物合成基因簇可能在真菌物種分化的早期就已經存在，或能夠通過水平基因轉移在不同種屬之間進行交換。