升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的保護作用

滿 緩，張 鳳，黃豆豆，熊筱娟，詹 勤，廖麗娜，李鐵軍，陳萬生

(1.海軍軍醫大學附屬長征醫院藥材科，上海 200003；2.宜春學院化學與生物工程學院，江西 宜春 336000; 3.海軍軍醫大學藥學院藥理教研室，上海 200433)

阿霉素屬于蒽環類抗癌藥[1]，對白血病、前列腺癌、肝癌等實體瘤有非常明確的療效[2]，但在臨床應用中會產生心臟毒性的副作用，隨著使用劑量的增加，可使得心肌產生不可逆性損傷，最終發展成為充血性心力衰竭[3]。近年來對阿霉素所致心臟毒性的機制考察主要著重于自由基、鈣超載、細胞凋亡和線粒體損傷等方面[4]。已有實驗結果顯示，阿霉素可使心肌細胞內活性氧含量增加[5]。有學者研究表明，阿霉素可使心肌細胞中鈣離子濃度升高，從而導致細胞形態學發生改變[6]，但阿霉素的心臟毒性機制尚未有明確的定論[7]。如何在應用阿霉素治療腫瘤時又能減少其心臟毒性，尋找對其有效的防護藥物，具有重大臨床意義。

升陷湯為近代著名中醫學家張錫純先生所創，記載于《醫學衷中參西錄》，組方配比為黃芪∶柴胡∶升麻∶知母∶桔梗=6∶1.5∶1∶3∶1.5[9]。方中生黃芪補氣升陷為主藥，知母涼潤制主藥之溫燥，柴胡、升麻助黃芪升陷之力，桔梗載藥力上達胸中，共奏升補大氣之效[10]。目前臨床用于治療冠心病心絞痛、慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病，應用十分廣泛[12]。但尚未見應用于阿霉素或其他抗腫瘤藥物心臟毒性的治療，故本實驗采用阿霉素誘導心肌細胞損傷模型，考察升陷湯及各單味藥對阿霉素心臟毒性的影響。

1 材料和儀器

1.1 實驗動物

采用3 d的SD乳鼠(雌雄不限)，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物飼養于第二軍醫大學實驗動物中心SPF級實驗室，常規飼養條件飼養。許可證號SYXK(滬)2007-0005，所有實驗動物均獲得第二軍醫大學動物倫理委員會的準許。

1.2 實驗試劑與儀器

黃芪、知母、柴胡、升麻和桔梗飲片(上海長征醫院藥材科)；Milli-Q純凈水(美國Millipore)；Fura-2/AM(中國科學院上海生理所)；生理鹽水(上海長征醫院提供)；0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)；高糖DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)及小牛血清(FCS，美國Gibco公司)；MTT工作液(美國sigma公司)；二甲基亞砜(德國GmbH公司)；LDH試劑盒(南京建成公司)；DCFH-DA、Fluo-3 AM(碧云天生物有限公司)；D-Hanks緩沖液(上海研卉生物科技有限公司)；PBS緩沖液(南京滴純生物科技有限公司)；其他試劑為分析純。

多功能酶標儀(美國Multiskan MK3)；倒置熒光顯微鏡(重慶光學儀器)；低溫冰箱(海爾集團)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CO2細胞培養箱(德國Heraeus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；無菌操作超凈臺(蘇州凈化設備公司)；LD4-2型離心機(北京醫用離心機廠)；79-1型磁力攪拌器(江蘇周莊科研儀器廠)；YJ-II型超聲波細胞粉碎機(上海新芝生物技術研究所)。

1.3 樣品制備

1.3.1升陷湯全方提取物(藥物SXT)

升陷湯組方飲片(黃芪600 g，知母300 g，柴胡150 g，桔梗150 g和升麻100 g)，先加入5 L的水浸泡24 h后，再煎煮，重復3次，將濃縮水煎煮液合并至650 ml，按原生藥量將濃度記為2.0 g/ml。水煎液放置在4 ℃冰箱，冷藏備用。

1.3.2單味藥材提取物

升陷湯組方各單味藥材，制備方法同“1.3.1”，得黃芪(藥物A)、知母(藥物B)、柴胡(藥物C)、桔梗(藥物D)和升麻(藥物E)提取物。

2 試驗方法

2.1 原代心肌細胞的提取和純化

參考文獻的制作方法[13]，取出生1～3 d的SD乳鼠，先用75%的酒精消毒，在無菌條件下開胸取出心臟，放入預冷的1×D-Hanks緩沖液中，洗滌2～3次，取心尖部組織剪為1 mm3左右的碎塊，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的0.08%胰蛋白酶溶液消化7 min，待自然沉淀后棄上清液一次，以后每次取上清液，加含20%FBS的DMEM培養基終止消化。重復此步驟直至組織塊消化完全。中和的上清液1 500 r/min離心10 min，棄上清液，用培養基再洗一遍，1 000 r/min離心5 min。棄上清液，用含10%的FBS和10%的FCS的DMEM培養基重懸后，采用差速貼壁法純化細胞2次，每次45 min，取細胞懸液，鋪板，每毫升細胞數5×105。鋪板，放入5% CO2培養箱中培養，隔天更換培養液，培養直到心肌細胞出現自發搏動。

2.2 阿霉素心臟毒性模型復制和藥物干預

收集生長健康的心肌細胞隨機分為8組。正常對照組(Con 組)，健康的心肌細胞；模型組(M組)，用阿霉素終濃度500 ng/ml，孵育24 h造心肌細胞損傷模型；藥物干預組(SXT、A、B、C、D和E)，用阿霉素終濃度500 ng/ml，孵育24 h造心肌細胞損傷模型，在孵育的同時加入升陷湯全方提取物、各單味藥材提取物，藥物濃度分別為75 μg/ml和150 μg/ml。

2.3 指標檢測

2.3.1藥物對阿霉素損傷心肌細胞活力的影響

細胞鋪96孔板培養，2～4 d后，心肌細胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養基培養24 h后，取出每孔加入MTT(5 mg/ml)應用溶液20l，37 ℃繼續孵育4 h，終止培養，取出去除培養基，加入150l的DMSO，用酶標儀充分震蕩5 min，在492 nm波長下讀數，測定各孔吸光度OD值。細胞存活率=(試驗組光吸收值/對照組光吸收值)×100%。

2.3.2藥物對阿霉素損傷心肌細胞LDH的影響

細胞鋪96孔板培養，2～4 d后，心肌細胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養基培養24 h后，吸出100l培養液，放入到一新的96孔板相應孔中。按照試劑盒說明書分為空白孔、標準孔、藥品孔、對照孔，在不同相應的對照孔中加入不同的試劑(雙蒸水、0.2 mmol/L標準液、待測藥物組、基質緩沖液、輔酶I)，混勻，37℃溫浴15 min，之后加入2,4-二硝基苯肼25l，混勻，37 ℃溫浴15 min，再加入0.4 mmol/L NaOH溶液250l，混勻，室溫放置5 min，用酶標儀在450 nm波長下讀數，測定各孔吸光度OD值。計算公式：細胞上清液中LDH活性(U/L)=(測定OD值-對照OD值)/(標準OD值-空白OD值)×標準品濃度(0.2 mmol/L)1 000。

2.3.3藥物對阿霉素損傷心肌細胞內活性氧和鈣離子濃度的影響[14]

原代心肌細胞內活性氧水平和鈣離子濃度檢測分別采用多功能酶標儀檢測熒光探針ROS(DCFH-DA)和鈣離子濃度(Fluo-3 AM)的熒光強度。細胞鋪96孔板培養，2～4 d后，心肌細胞基本全部跳動，按照實驗分組分別加入含有不同濃度藥物的培養基培養24 h后，去除培養基，加入稀釋好的含有DCFA-DA(Fluo-3 AM)的無血清的DMEM，37℃繼續孵育30～60 min后，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，在多功能酶標儀激發波長488 nm，發射波長525 nm下檢測細胞內熒光。以模型組為對照組，其余組與模型組的比值為其相對熒光數值。

2.3.4統計學處理方法

3 實驗結果

3.1 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的影響

MTT結果顯示阿霉素刺激心肌細胞24 h后，能顯著降低細胞活力。當同時給與升陷湯及各單味藥治療后，在濃度為75g/ml時，升陷湯全方以及黃芪、知母、桔梗單味藥能夠顯著增強細胞活力，與模型組比較，差異具有統計學意義；柴胡、升麻單味藥雖也增加了細胞活力，但與模型組比較差異不明顯，無統計學意義；在濃度為150g/ml時，與模型組比較，升陷湯及各單味藥均能夠顯著增強細胞活力，差異具有統計學意義。結果表明在75g/ml、150g/ml濃度時，升陷湯全方以及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷具有一定保護作用(圖1)。

圖1 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷模型的影響 *P<0.05與模型組比較；##P<0.01與正常組比較

3.2 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的細胞內鈣離子濃度的影響

結果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強心肌細胞內鈣離子的濃度，差異具有統計學意義。與模型組相比，當給予升陷湯及各單味藥治療后，在藥物濃度75g/ml時，除升陷湯全方，各單味藥均可以降低細胞內鈣離子濃度，差異具有統計學意義；在藥物濃度150g/ml時，升陷湯全方和各單味藥均可以降低細胞內鈣離子濃度，差異具有統計學意義。表明升陷湯全方及單味藥可以降低阿霉素引起的心肌細胞內升高的鈣離子濃度，具有保護心肌細胞損傷作用(圖2)。

3.3 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的細胞內LDH含量的影響

結果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強心肌細胞LDH濃度，差異具有統計學意義。與模型組相比，當同時給予升陷湯及各單味藥治療后，在濃度為75g/ml、150g/ml時，升陷湯全方及各單味藥(除黃芪外)均能夠降低細胞LDH的含量，差異具有統計學意義。表明升陷湯全方及單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷具有保護作用(表1)。

圖2 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的細胞內鈣離子的影響 *P<0.05，**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

3.4 升陷湯及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷的細胞內ROS含量的影響

結果顯示：與正常組相比，阿霉素能夠顯著增強心肌細胞內ROS的濃度，差異具有統計學意義。與模型組相比，當同時給予升陷湯及各單味藥治療后，在藥物濃度75g/ml時，升陷湯、知母和柴胡可以降低細胞內鈣離子濃度，差異明顯；在藥物濃度150g/ml時，升陷湯、黃芪、知母、柴胡可以降低細胞內ROS，差異具有統計學意義，桔梗、升麻對ROS的濃度無影響(圖3)。

表1 藥物對阿霉素致心肌細胞損傷LDH的影響

*P<0.05，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

圖3 升陷湯全方及各單味藥對阿霉素致心肌細胞損傷細胞內ROS的影響 *P<0.05、**P<0.01，與模型組比較；##P<0.01，與正常組比較

4 討論

蒽環類藥物為臨床上抗腫瘤常用的藥物，對血液系統以及各種實體瘤有較好的治療效果[15]，阿霉素是其代表藥物，已廣泛應用于臨床上一些癌癥的治療，并取得了顯著的療效，延長了患者的生命，并提高了其生活質量，但阿霉素帶來的心臟毒性、骨髓抑制、消化道損傷等副作用，使得阿霉素的臨床應用受到一定限制[16]。其中，由于阿霉素與心肌細胞具有較高的親和力，其導致的心臟毒性也成為最嚴重的毒性反應[15]。阿霉素進入體內后，一方面，在線粒體和微粒體中導致一系列的自由基和超氧化物的生成，可與體內的有機物及一些生物膜發生反應，從而改變生物膜的流動性，進而損傷細胞的功能[4]，另一方面，可引起心肌細胞內鈣離子升高，從而造成心肌細胞代謝紊亂以及能量代謝障礙。

臨床上升陷湯廣泛用于冠心病、心絞痛的治療，慢性充血性心力衰竭、病毒性心肌炎等疾病[17]，但升陷湯所帶來的心肌細胞損傷也不容忽視。有報道稱，心肌細胞內ROS含量增加，會降低細胞的抗氧化能力[18]，會產生細胞的凋亡[19]。LDH含量的增加提示，心肌細胞在使用阿霉素的情況下，發生了細胞的過氧化過程，而LDH的含量也是對心肌細胞損傷的提示[20]。Ca2+的增多，會使心肌細胞內Ca2+超載，產生心律失常[21]。

本課題通過體外細胞實驗從阿霉素致心肌細胞損傷，基于心肌細胞凋亡角度考察，證實了升陷湯以及各單味藥的保護作用，可通過降低細胞內ROS、LDH水平以及Ca2+的濃度實現，在早期阿霉素治療中如果應用升陷湯，一定程度上能降低阿霉素的心臟毒性作用。在本次實驗中升陷湯全方在降低細胞內ROS、LDH和提高生存率方面明顯強于其他任何單味藥材處理組，部分證實了升陷湯全方治療“大氣下陷”的合理性，但實驗中缺少對不同藥材組合的考察去證實君臣佐使的配伍機制，需要在后期實驗進行彌補。本實驗結果為阿霉素導致的心臟毒性提供了新的治療思路，但離體實驗與在體情況仍有許多差別，實驗結論還需進一步在在體實驗中證實。