異丙酚對卵巢癌SKOV3細胞克隆形成、侵襲、EMT和miR-143表達的影響

田文珺，劉士佳，劉曉明，吳 越

大連醫科大學附屬第一醫院麻醉科 遼寧大連 116000

異丙酚化學名2,6-二異丙基苯酚，是麻醉誘導、麻醉維持和重癥監護室鎮靜常用的靜脈用麻醉藥物。越來越多的研究[1-3]證實，異丙酚具有抑制肺癌、肝癌和胰腺癌等腫瘤細胞惡性增殖和轉移的作用。微小RNAs(miRNAs)是一類與細胞生物學行為關系密切的非編碼RNA，miR-143是miRNAs中的重要成員，被證實在乳腺癌、食管癌和骨肉瘤等腫瘤中可通過調控細胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)等功能，發揮抑癌基因的作用[4-6]。已有研究[7-8]指出異丙酚可通過上調miR-143表達抑制骨肉瘤MG63細胞增殖和侵襲。本研究通過觀察異丙酚對卵巢癌SKOV3細胞克隆形成、侵襲、EMT和miR-143表達的影響，探討異丙酚與卵巢癌細胞轉移的關系和可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1研究對象SKOV3細胞株(美國ATCC公司)，miR-143抑制劑及其陰性對照(廣州瑞博生物公司)，異丙酚(美國Sigma公司)，Trizol試劑、Lipofectamine 2000和反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，RPMI 1640培養基、 胎牛血清、青霉素、鏈霉素(美國Gibco公司)，兔抗人 E-cadherin和Vimentin 單克隆抗體(武漢三鷹生物公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，HRP標記山羊抗兔/鼠 IgG(北京中杉金橋生物技術有限公司)。PCR相關試劑(北京康為世紀生物公司)，總蛋白提取試劑盒(上海碧云天生物公司)。倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，7500型熒光定量PCR儀 (美國ABI公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，恒溫細胞培養箱(德國 Thermo公司)。

1.2SKOV3細胞培養和處理將SKOV3細胞培養在含有體積分數10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI 1640培養基中，常規培養條件為相對濕度為95%、體積分數5%CO2和溫度37 ℃。將對數生長期的SKOV3細胞以105個/mL和每孔200 μL接種至96孔細胞板上，在常規培養條件下培養過夜。分別以0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L異丙酚刺激SKOV3細胞48 h后，收集各組細胞進行后續實驗，每組設3個復孔。

1.3軟瓊脂集落形成實驗檢測SKOV3細胞克隆形成能力收集各組細胞，以每組103個細胞接種至頂層含3 g/L、底層含5 g/L瓊脂糖的軟瓊脂上，常規培養條件下培養2周后，收集各組細胞，于顯微鏡下觀察，統計克隆形成數。以細胞數大于50作為有效克隆。以克隆形成數與接種細胞數的百分比表示克隆形成率。實驗重復3次。

1.4Transwell小室實驗檢測SKOV3細胞侵襲能力以濃度為250 mg/L的 Matrigel溶液100 μL包被孔徑為8 μm的Transwell小室上、下室間的聚碳酸酯微孔膜。各組SKOV3細胞采用無血清培養基稀釋至104個/mL。在小室下室中加入含胎牛血清的培養基500 μL，上室中加入細胞懸液200 μL，置于常規條件下培養過夜。取出小室，小心拭去上室濾膜上的細胞，并以40 g/L多聚甲醛對濾膜下層細胞進行固定，結晶紫染色。顯微鏡下觀察并統計穿膜細胞數。以選取的5個視野細胞數的均值表示侵襲細胞數。實驗重復3次。

1.5Western blot檢測SKOV3細胞E-cadherin和Vimentin的表達將各組SKOV3細胞參照總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白。向蛋白樣品中加入2×loading buffer煮沸5 min后，以每孔60 μg上樣至SDS-PAGE中進行電泳，使用轉膜儀將蛋白轉至PVDF膜上。室溫下，以50 g/L脫脂奶粉封閉膜1 h。以PBST洗膜，加入1∶500稀釋的E-cadherin和Vimentin抗體，4 ℃下孵育過夜。洗膜，室溫下加入1∶1 000稀釋的HRP標記山羊抗兔/鼠IgG孵育1 h。再次洗膜，滴加發光液避光顯影。以β-actin為內參進行凝膠成像系統掃描分析。實驗重復3次。以目的蛋白與內參灰度值的比值作為目的蛋白的表達水平。

1.6實時熒光定量RT-PCR檢測SKOV3細胞中miR-143的表達收集各組SKOV3細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，并用反轉錄試劑盒合成cDNA。其中，miR-143引物(上游：5’-CAGTGCGT GTCGTGGAG-3’，下游：5’-GCGGTGAGATGAAGCACT-3’)和內參U6引物(上游：5’-CTCAGAGCGT GGTTCTCCGTCAC-3’，下游：5’-TATAAATCTTTAC CCTGTTGGCAGT-3’)由南京金斯瑞生物公司合成。取cDNA 1 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR上下游引物各0.4 μL、50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL和ddH2O28.8 μL配制成總體積為20 μL的PCR體系。反應條件：94 ℃預變性20 s;94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，共45個循環。采用2-ΔΔCt法計算miR-143的相對表達量。實驗重復3次。

1.7下調miR-143對異丙酚刺激的SKOV3細胞的影響將SKOV3細胞按照每孔3×105個接種至6孔細胞板上，常規條件下培養過夜，當細胞融合大于70%時，參照Lipofectamine 2000說明書分別將miR-143抑制劑及其陰性對照轉至SKOV3細胞中，轉染24 h后加入終濃度為10.0 μmol/L異丙酚刺激48 h。另設未經任何處理的SKOV3細胞作為對照組，只給予10.0 μmol/L異丙酚處理而未轉染的SKOV3細胞作為異丙酚組。待處理結束后，收集各組細胞，采用軟瓊脂集落形成實驗和Transwell小室實驗檢測細胞克隆形成能力和侵襲能力，Western blot法分別檢測EMT相關E-cadherin和Vimentin蛋白的表達。

1.8統計學處理采用SPSS 22.0進行分析，各組間細胞克隆形成率、侵襲細胞數、E-cadherin和Vimentin蛋白表達水平、miR-143表達水平的比較使用單因素方差分析和SNK-q檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1異丙酚對SKOV3細胞克隆形成和侵襲能力的影響見表1。

2.2異丙酚對SKOV3細胞E-cadherin和Vimentin表達的影響見圖1和表1。

2.3異丙酚對SKOV3細胞中miR-143表達的影響見表1。

表1 各組細胞克隆形成率，侵襲細胞數，E-cadherin、Vimentin蛋白表達和miR-143表達的比較(n=3)

各指標組間兩兩比較，P均<0.05

1～4：分別為0.0、2.5、5.0和10.0 μmol/L異丙酚組

2.4下調miR-143對異丙酚處理的SKOV3細胞的影響見圖2和表2。

1～4：分別為對照組、異丙酚組、miR-143陰性對照組和miR-143抑制組

圖2各組細胞中E-cadherin和Vimentin蛋白的表達

表2 各組細胞miR-143的表達、克隆形成和侵襲能力、E-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較(n=3)

*：與對照組比較 ,P<0.05；#：與異丙酚和miR-143陰性對照組比較，P<0.05

3 討論

目前，麻醉藥在腫瘤中的作用是有害還是有益逐漸引起人們的關注。隨著研究的不斷深入，常用的靜脈用麻醉藥物異丙酚在腫瘤中的作用逐漸被發現和了解。Yang等[9]在關于胃癌的研究中指出，異丙酚可通過上調ING3表達抑制癌細胞的體外生長和存活。Du等[10]發現，異丙酚可通過下調SOX4表達抑制子宮內膜癌細胞的增殖、遷移和侵襲并促進細胞凋亡。Liu等[1]研究指出，異丙酚可能通過上調miR-1284抑制肺癌A549細胞的存活、遷移、侵襲和EMT過程。Sun等[11]發現，異丙酚可通過下調miR-372抑制肺癌A549細胞的生長、遷移和侵襲。以上研究證實異丙酚可通過不同的作用機制抑制腫瘤細胞惡性增殖與轉移。

miR-143是一個與腫瘤發生發展關系密切的miRNA，可通過多個靶基因抑制腫瘤細胞的增殖和轉移，發揮抑癌基因的作用[12]。Zhai等[13]認為異常低表達的miR-143可通過下調ERK5在乳腺癌EMT進程和腫瘤生長過程中發揮抑制作用。Lei等[14]研究發現，miR-143可通過靶向MYO6調節EMT，從而抑制胃癌細胞轉移。研究[7，15]證實，miR-143在卵巢癌的發生發展過程中發揮著類似抑癌基因的作用。Ye等[8]指出，上調miR-143表達是異丙酚抑制骨肉瘤細胞增殖和侵襲的重要機制。盡管已有研究[16]證實，異丙酚對卵巢癌細胞生長和侵襲有一定的抑制作用，但其是否通過miR-143參與抑制癌細胞的轉移尚不完全清楚，而EMT是癌細胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學過程，其中間質指標Vimentin蛋白表達升高，上皮指標E-cadherin蛋白表達降低是EMT發生重要標志。本研究以異丙酚刺激卵巢癌SKOV3細胞48 h，發現異丙酚可呈濃度依賴性地抑制SKOV3細胞克隆形成和侵襲能力，下

調Vimentin和上調E-cadherin表達，并促進miR-143表達；而轉染miR-143抑制劑后，異丙酚對SKOV3細胞的上述作用明顯逆轉。以上結果提示，miR-143表達上調是異丙酚抑制SKOV3細胞轉移的重要機制。

綜上所述，異丙酚可能通過上調miR-143表達抑制卵巢癌SKOV3細胞轉移，該結果為異丙酚成為卵巢癌手術治療中的理想麻醉藥提供了參考。