miR-422a過表達聯合EPO對H2O2誘導的PC12細胞活力、凋亡及PI3K/AKT信號通路的影響

顧 然，王 露，唐 蔓，胡 曉

貴州省人民醫院神經內科 貴陽 550002

有研究[1-2]表明，帕金森病、阿爾茨海默癥等多種神經退行性疾病的發生發展與氧化應激密切相關。過氧化氫(H2O2)是一種氧化性較強的活性氧，可誘導細胞氧化應激損傷。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類高度保守、長18～25個核苷酸的非編碼小分子RNA，可通過與目標基因的3’-UTR結合，在轉錄水平調節目標基因表達[3]。miR-422a是miRNAs家族成員之一，有研究[4]表明，在H2O2誘導的大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞PC12細胞凋亡模型中，miR-422a的表達降低，提示miR-422a可能在神經損傷過程中有重要作用。促紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)是一種具有抗氧化、調節紅細胞生成、抗炎、抗細胞凋亡等多種生物學效應的細胞因子;在多種神經系統疾病模型中發揮保護作用，其保護作用機制可能與抗氧化應激、抗凋亡、抗炎作用等有關[5-6]。本研究旨在分析過表達miR-422a和EPO單獨或聯合作用對H2O2誘導的PC12細胞活力和凋亡的影響，并進一步研究其作用機制，以探討miR-422a是否可增強EPO對氧化損傷的PC12細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自杭州四季青生物工程材料有限公司，MTT試劑盒、DMSO均購自美國Sigma公司，鼠抗人AKT、p-AKT抗體均購自美國CST公司，細胞凋亡檢測試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司，總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司,miR-422a mimics 及空質粒均購自上海吉瑪制藥技術有限公司，LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司，酶標儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2細胞培養PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫。細胞在體積分數5%CO2、37 ℃條件下，用含體積分數10%FBS的DMEM培養基培養。2～3 d換液一次。細胞進入對數生長期后，用胰蛋白酶消化、傳代。

1.3實驗分組及處理將PC12細胞分為6組。空白組：細胞不經特殊處理；H2O2組：細胞用300 μmol/L H2O2處理4 h；miR-NC組：H2O2刺激前細胞轉染空質粒48 h；miR-422a組：H2O2刺激前細胞轉染miR-422a mimics 48 h(100 nmol/L)；EPO組：H2O2刺激前用1 IU/mL EPO處理細胞2 h；miR-422a+EPO組：H2O2刺激前用miR-422a mimics及EPO同上處理細胞(先轉染，后加EPO)。將PC12細胞以2×105個/孔接種于6孔板，于培養箱內常規培養，細胞達50%～70%生長融合度時開始轉染，參照LipofectamineTM2000試劑盒說明操作。

1.4qRT-PCR檢測miR-422a的表達用總RNA提取試劑盒提取空白組、H2O2組、miR-NC組、miR-422a組細胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度，應用反轉錄試劑盒合成cDNA。miR-422a及內參U6引物由上海吉瑪公司設計并合成。miR-422a上游引物為5’-GGGACTGGACTTAGGGTCA-3’，下游引物為5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’，產物63 bp；U6上游引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，下游引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，產物78 bp。反應體系(20 μL)：2×SYBR premix Ex TaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dyell 0.4 μL， cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.6 μL；反應條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環。每組設6個復孔，取Ct均值，采用2-ΔΔCt法計算miR-422a相對表達量。實驗重復3次。

1.5細胞活力檢測取對數生長期的PC12細胞，調整細胞密度為2×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，過夜培養。按1.3中實驗分組處理后，每孔加MTT溶液(5 g/L)10 μL，繼續孵育4 h，吸去培養液，每孔加150 μL DMSO，繼續孵育10 min，酶標儀測定570 nm處的吸光度(A)值，代表細胞活力。每組設置5個復孔，實驗重復3次。

1.6細胞凋亡檢測取對數生長期的PC12細胞，以3×104個/孔接種于24孔板，常規培養24 h。按1.3中實驗分組處理后，以預冷PBS洗滌細胞，加Annexin V binding buffer懸浮細胞，混勻，加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL PI，輕柔混勻，避光室溫反應15 min，加200 μL Annexin V binding buffer 400 μL，1 h內上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.7AKT、p-AKT蛋白檢測收集各處理組細胞，加適量裂解液提取總蛋白，BCA法定量蛋白濃度。蛋白經100 ℃變性后，上樣，每孔道40 μg，經120 g/L SDS-PAGE分離、轉NC膜、50 g/L脫脂奶粉封閉，使用封閉液稀釋一抗(鼠抗AKT、p-AKT抗體及內參GAPDH抗體均按1∶1 000稀釋)，室溫搖床孵育3～4 h，洗膜，加HRP標記的山羊抗鼠IgG抗體(按1∶5 000稀釋)，37 ℃孵育1 h，洗膜，ECL顯色，顯影。Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。實驗重復3次。

1.8統計學處理應用SPSS 21.0處理數據，采用單因素方差分析比較各組以上指標的差異，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1轉染miR-422a mimics對H2O2誘導的PC12細胞miR-422a表達的影響如表1所示，H2O2刺激可降低PC12細胞miR-422a表達，轉染miR-422a mimics后PC12細胞中miR-422a表達較H2O2組升高。

表1 4組細胞miR-422a 表達的比較

F=339.935,P<0.001;*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.2過表達miR-422a或EPO對H2O2誘導的PC12細胞活力的影響如表2所示，H2O2刺激可降低PC12細胞活力，而過表達miR-422a及EPO均可提高細胞活力，兩者合用對細胞活力的增強作用更強。

2.3過表達miR-422a或EPO對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的影響如表2所示，H2O2刺激可誘導PC12細胞凋亡，而過表達miR-422a及EPO均可降低細胞凋亡率，兩者合用對細胞凋亡的抑制作用更強。

2.4過表達miR-422a或EPO對H2O2誘導的PC12細胞AKT及p-AKT蛋白表達的影響如圖1和表2所示，H2O2刺激可下調PC12細胞p-AKT表達，而過表達miR-422a及EPO均可上調細胞p-AKT表達，兩者合用對細胞p-AKT表達的上調作用更強。

1～6：分別為空白組、H2O2組、miR-NC組、miR-422a組、EPO組、miR-422a+EPO組

圖1過表達miR-422a或EPO對H2O2誘導的PC12細胞AKT、p-AKT蛋白表達的影響

表2 6組細胞細胞活力、凋亡率及AKT、p-AKT蛋白相對表達量比較

*:與空白組比較，P<0.05；#:與H2O2組比較，P<0.05；△:與miR-422a組及EPO組比較，P<0.05

3 討論

機體內活性氧過多可觸發細胞的自由基鏈式反應，發生脂質過氧化反應，損傷細胞膜結構，影響酶功能、蛋白質結構及基因表達，引起細胞的氧化損傷[7-8]。H2O2、谷氨酸鹽、t-BHP等常用于制作氧化損傷模型，由于H2O2具有易于取得、性質比較穩定等特點，應用最為廣泛[9]。PC12細胞可長出類似神經元細胞的突觸，有神經細胞的特性，又有增殖快的特點，因此成為神經細胞生理病理研究常用的細胞模型[10]。有研究[11]表明，300 μmol/L H2O2處理PC12細胞4 h，可抑制近一半的細胞活力，因此，本研究使用300 μmol/L H2O2刺激PC12細胞，建立細胞氧化損傷模型，研究結果顯示，H2O2可抑制PC12細胞活力，誘導細胞凋亡，說明建立的PC12細胞氧化損傷模型成功。

miRNA在不同生物中有高度保守性，參與調控細胞凋亡、脂肪代謝、細胞分化、神經元發育等多種病理生理過程。miR-422a是miRNA大家族成員之一，與膠質母細胞瘤、肺癌等多種腫瘤細胞生長有關[12-13]。在H2O2誘導的PC12細胞凋亡模型[5]中，miR-422a表達下調，提示miR-422a可能參與PC12細胞凋亡調控。本研究結果亦顯示，H2O2可下調PC12細胞miR-422a表達，而過表達miR-422a可增強氧化損傷的PC12細胞的活力，抑制細胞凋亡，從而減弱氧化應激誘導的細胞損傷。

EPO是主要在肝臟和腎臟產生的一種糖蛋白生血因子，能促進紅細胞生成。有研究[14]證實，中樞神經系統中存在EPO及其受體基因表達，且EPO具有神經營養作用。研究[15]顯示，EPO有強大的神經保護作用，如EPO可明顯增強1-甲基-4苯基吡啶離子等誘導的PC12細胞活力，降低細胞凋亡率。本研究結果顯示，EPO可增強H2O2誘導氧化損傷的PC12細胞活力，抑制凋亡，而過表達miR-422a與EPO聯合作用在增強細胞活力和抑制細胞凋亡方面均優于單用。

PI3K/AKT是細胞內一條重要的信號通路，在中樞神經系統中，該信號通路是神經元存活的主要途徑之一[16]。有研究[17]表明，PI3K/AKT信號通路活化對H2O2誘導的PC12細胞凋亡起保護作用。AKT是PI3K/AKT信號通路的中心環節，AKT活化后可通過調節下游相關基因表達而影響細胞生物學過程[18]。本研究結果顯示，過表達miR-422a及EPO均可上調H2O2誘導的PC12細胞的p-AKT水平，兩者合用對p-AKT水平上調作用更強。提示miR-422a及EPO可能通過激活PI3K/AKT信號通路保護神經細胞免受氧化損傷。

綜上所述，過表達miR-422a及EPO均可抵抗H2O2誘導的PC12細胞氧化損傷，兩者合用效應更強，其機制可能與激活PI3K/AKT信號通路有關；miR-422a可能是神經損傷治療的分子靶點之一。