胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)與胚胎種植率的關(guān)系

石森林，呂愛(ài)香，宋文妍，金海霞

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心 鄭州 450052

傳統(tǒng)的胚胎選擇方法已有20多年的歷史，許多形態(tài)學(xué)參數(shù)被作為選擇胚胎的依據(jù)，如原核形態(tài)評(píng)分[1-2]、極體排列和外觀[3]、細(xì)胞質(zhì)外觀和透明帶形態(tài)[4]、早期卵裂[5-6]等。胚胎的發(fā)育動(dòng)力學(xué)是預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育潛能的重要因素[7]。延時(shí)攝像技術(shù)是一項(xiàng)新技術(shù)，在胚胎學(xué)實(shí)驗(yàn)室中具有增強(qiáng)胚胎選擇的巨大潛力。這種胚胎的非侵入性客觀評(píng)估為預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育和植入潛力提供了新的思路。延時(shí)攝像系統(tǒng)能夠通過(guò)動(dòng)態(tài)方法改善胚胎選擇，它增加了發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為胚胎評(píng)估提供了新的方法，有利于胚胎植入率和生殖結(jié)局的改善。為進(jìn)一步探討胚胎動(dòng)力學(xué)對(duì)胚胎種植的影響，本文分析了完全種植胚胎和未種植胚胎的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，旨在從發(fā)育動(dòng)力學(xué)方面選擇更具發(fā)育潛力的胚胎。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象及分組以2016年11月至2018年4月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心利用EmbryoScope Timelapse胚胎培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行胚胎監(jiān)測(cè)和篩選的316個(gè)種植率為0%或者100%(孕囊數(shù)等于移植胚胎個(gè)數(shù))的常規(guī)體外受精(invitrofertilization,IVF)周期為研究對(duì)象，將種植率為0%者納入未種植組(n=146)，種植率為100%者納入種植組(n=170)，兩組共移植胚胎601枚(未種植組242枚，種植組359枚)。納入標(biāo)準(zhǔn)：女方年齡≤35歲；女方不孕原因均為輸卵管因素，排除子宮畸形、子宮腺肌癥、子宮肌瘤等有子宮問(wèn)題的患者。

1.2胚胎培養(yǎng)方法HCG后39～40 h進(jìn)行微滴法短時(shí)授精，調(diào)精子密度為1×106個(gè)/mL，授精4 h后用150 μm孔徑的剝卵針(Sunlight,美國(guó))反復(fù)吹打，機(jī)械性去除卵子顆粒細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察極體排出情況，以排出第二極體為受精標(biāo)志。確認(rèn)受精后將胚胎轉(zhuǎn)移至EmbryoScope專(zhuān)用12孔培養(yǎng)皿中，每孔1個(gè)胚胎，培養(yǎng)72 h。所用培養(yǎng)液為G-1生長(zhǎng)液(Vitrolife公司，瑞典)加體積分?jǐn)?shù)10%血清蛋白替代物(IrvineScientific公司，美國(guó))。EmbryoScope培養(yǎng)箱環(huán)境參數(shù)為：體積分?jǐn)?shù)6%CO2、體積分?jǐn)?shù)5%O2和體積分?jǐn)?shù)89%N2，培養(yǎng)溫度為37 ℃。培養(yǎng)箱設(shè)置：5個(gè)不同焦平面上每隔10 min采集圖像。

1.3胚胎的動(dòng)力學(xué)參數(shù)以授精時(shí)間(即將精子加入卵子中)為時(shí)間起點(diǎn),評(píng)價(jià)胚胎的發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)包括：授精至原核出現(xiàn)時(shí)間(tPNa)、授精至原核消失時(shí)間(tPNf)、授精至二細(xì)胞時(shí)間(t2)、授精至三細(xì)胞時(shí)間(t3)，并以此類(lèi)推定義t4、t5、t6、t7、t8。第二次細(xì)胞分裂周期(cycle2，簡(jiǎn)稱(chēng)cc2)即t3-t2，s2代表第二次細(xì)胞分裂的同步性(即t4-t3)。

1.4臨床結(jié)局移植后第35天B超下可見(jiàn)到孕囊及胎心為臨床妊娠。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。未種植組和種植組患者基本情況及胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)；用四分位法對(duì)動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分段統(tǒng)計(jì)，將種植率最高時(shí)間段定義為優(yōu)勢(shì)時(shí)間段，優(yōu)勢(shì)時(shí)間段與其他時(shí)間段種植率的比較采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1未種植組和種植組患者基本情況比較未種植組和種植組患者年齡、不孕時(shí)間、體質(zhì)指數(shù)、FSH、AMH、Gn用量、Gn時(shí)間、內(nèi)膜厚度、獲卵總數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 未種植組和種植組患者基本情況比較

2.2未種植組和種植組胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較種植組胚胎tPNa、tPNf、t2、t3、t4、t6、t7、t8、s2均短于未種植組,但兩組胚胎t5、cc2比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 未種植組和種植組胚胎動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較 h

2.3胚胎種植情況四分位法分析結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，1.94 h≤tPNa<7.73 h、15.53 h≤tPNf<21.08 h、17.87 h≤t2<23.59 h、22.15 h≤t3<36.52 h、55.87 h≤t4<37.63 h、31.52 h≤t5<53.66 h、32.58 h≤t6<55.37 h、33.58 h≤t7<57.20 h、40.88 h≤t8<59.71 h、0.18 h≤s2<1.23 h、cc2<12.10 h更有利于胚胎種植，其中15.53 h≤tPNf<21.08 h、17.87 h≤t2<23.59 h種植率均高于其他3個(gè)時(shí)間段。

表3 胚胎種植情況四分位法分析結(jié)果

*：與優(yōu)勢(shì)時(shí)間段種植率比較，P<0.001

3 討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展,通過(guò)選擇性單胚胎移植實(shí)現(xiàn)單胎妊娠是臨床追求的一個(gè)目標(biāo),這對(duì)胚胎種植率的提高提出了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。胚胎的種植與女性年齡、子宮內(nèi)膜容受性和胚胎情況有關(guān)，選擇最具發(fā)育潛力的胚胎是提高輔助生殖技術(shù)妊娠率的重中之重。為更好分析胚胎的動(dòng)力學(xué)參數(shù)與種植率之間的關(guān)系，本研究針對(duì)年齡≤35歲、因輸卵管因素不孕、無(wú)子宮問(wèn)題的常規(guī)IVF患者，全面分析胚胎從原核出現(xiàn)至八細(xì)胞期整個(gè)過(guò)程的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析范圍更廣泛。胚胎發(fā)育是一個(gè)持續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，并遵循一定的時(shí)間序列，受精后的合子分裂成兩個(gè)細(xì)胞，在三細(xì)胞階段短暫停留。有研究[8]發(fā)現(xiàn)三細(xì)胞期持續(xù)時(shí)間短的胚胎具有更好的發(fā)育潛力，該研究中也發(fā)現(xiàn)t3短組胚胎種植率更高，與上述研究結(jié)果基本一致。胚胎發(fā)育至三細(xì)胞之后再次分裂進(jìn)入更長(zhǎng)的四細(xì)胞階段，與四細(xì)胞期相比，五細(xì)胞期、六細(xì)胞期、七細(xì)胞期非常短，研究[9]發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育速度與妊娠率密切相關(guān)，且發(fā)育快的胚胎可能有更高的妊娠率[5]，除此之外，也有研究[10]發(fā)現(xiàn)高質(zhì)量囊胚比低評(píng)分囊胚在第2次和第3次分裂所需時(shí)間短，提示發(fā)育進(jìn)程快、分裂同步性好的胚胎可能有更好的發(fā)育潛能[11]。本研究結(jié)果顯示種植組胚胎tPNa、tPNf、t2、t3、t4、t6、t7、t8均短于未種植組胚胎，提示胚胎發(fā)育進(jìn)程快的胚胎種植率更高；除此之外，代表胚胎發(fā)育同步性的s2種植組也短于未種植組胚胎，提示分裂同步性好的胚胎種植率更高，這為選擇種植率最高的胚胎提供了依據(jù)。

有學(xué)者[12]根據(jù)胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)參數(shù)建立了一個(gè)分級(jí)模型對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)級(jí),認(rèn)為胚胎分裂至五細(xì)胞的時(shí)間即t5為48.8～56.6 h、s2<0.76 h以及cc2<11.9 h的胚胎發(fā)育潛能最大，國(guó)內(nèi)外也有研究[13-14]認(rèn)為t5可以作為選擇胚胎的一個(gè)時(shí)間參數(shù)。雖然本研究結(jié)果顯示，種植組和未種植組t5比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但四分位法分析胚胎種植情況結(jié)果顯示50.04 h≤t5<53.66 h種植率最高，與以往研究[11-12]結(jié)果相符合。s2更能代表胚胎發(fā)育的同步性[15], 卵裂同步性好的胚胎, 其發(fā)育至優(yōu)質(zhì)囊胚的幾率更大[16]。本研究結(jié)果顯示種植組s2短于未種植組胚胎，提示種植組胚胎發(fā)育同步性更好。cc2代表二細(xì)胞胚胎持續(xù)時(shí)間，本研究結(jié)果雖然顯示種植組和未種植組cc2無(wú)差異，但四分位法分析胚胎種植情況發(fā)現(xiàn)cc2<12.10 h有利于胚胎種植，這與以往研究[12，17-19]結(jié)果一致。

為進(jìn)一步分析時(shí)間參數(shù)與胚胎種植的關(guān)系，找出種植率最高時(shí)間段，本研究采用四分位法對(duì)tPNa、tPNf、t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8、cc2、s2進(jìn)行分段統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示在胚胎發(fā)育各時(shí)間段(除tPNa、t5外)，各時(shí)間參數(shù)第1區(qū)間種植率均最高，第4區(qū)間種植率均最低，這也進(jìn)一步說(shuō)明，胚胎發(fā)育速度影響種植率，進(jìn)程慢的胚胎種植率低。其中15.53 h≤tPNf<21.08 h和17.87 h≤t2<23.59 h時(shí)間段的種植率均高于其他時(shí)間段，提示核膜的適時(shí)消失對(duì)胚胎種植率有一定影響。由此，可以把15.53 h≤tPNf<21.08 h和17.87 h≤t2<23.59 h作為選擇胚胎的一個(gè)依據(jù)。

綜上所述，本研究結(jié)果提示胚胎發(fā)育進(jìn)程快的胚胎種植率更高，代表胚胎發(fā)育同步性的s2可以作為篩選胚胎的一個(gè)指標(biāo)；15.53 h≤tPNf<21.08 h和17.87 h≤t2<23.59 h的胚胎種植率高，但由于胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)受培養(yǎng)液、培養(yǎng)條件(氣體、濕度等)、受精方式等影響，后期仍然需要對(duì)胚胎發(fā)育動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更深入的研究。