KLF11過表達對H2O2誘導的H9c2心肌細胞活力及氧化應激水平的影響

王 濱,王文華,辛傳友,郭龍哲,黃傳奇，郜 陽,寧文龍

1)齊齊哈爾市第一醫院急診內科 黑龍江齊齊哈爾 161000 2)齊齊哈爾市第一醫院風濕科 黑龍江齊齊哈爾 161000 3)哈爾濱醫科大學附屬第二醫院重癥醫學科 哈爾濱 150000

氧化應激是指各種原因引起的機體活性氧(reactive oxygen species,ROS)蓄積過量，可引起細胞壞死，參與多種疾病的發生發展[1]。近些年的研究[2-3]顯示，心肌細胞凋亡在心力衰竭、冠心病、心肌缺血再灌注等多種心血管損傷病理過程中發揮重要作用。自由基清除劑、抗氧化劑等可減輕氧化應激，降低心肌細胞凋亡率，從而改善心功能[4]。因此，探索氧化應激引起心肌損傷的作用機制將為心血管疾病的治療提供極大的幫助。Kruppel樣轉錄因子家族(Kruppel-like factors，KLF)是一個高度保守的轉錄因子家族。KLF11基因是KLF家族成員之一，參與細胞增殖、凋亡、周期等活動的調節[5]。有研究[6]顯示，過表達KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纖維化，提示KLF11可能是心血管疾病治療的一個分子靶點。本研究以大鼠H9c2心肌細胞為研究對象，觀察過表達KLF11對過氧化氫(H2O2)誘導的H9c2細胞活力、凋亡的影響，并進一步探討可能的分子機制。

1 材料方法

1.1試劑和儀器pcDNA3.1-KLF11及空載體pcDNA3.1購自上海生工生物工程有限公司。DMEM/F12培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogen公司；MTT試劑盒購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；SOD檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒均購自南京建成生物有限公司；BCA試劑盒購自中國碧云天公司；鼠抗人KLF11、PI3K、p-AKT、Bcl-2和GAPDH單抗均購自美國CST公司；酶標儀購自美國Thermo公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2H9c2細胞來源及轉染H9c2細胞購自上海中科院細胞庫，用含體積分數10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養基，在體積分數5%CO2、37 ℃培養箱中培養。細胞達80%～90%融合時，棄去舊培養基，PBS洗滌，加入胰蛋白酶消化1～2 min，倒置顯微鏡下觀察。細胞由梭形變圓時終止消化，傳代。取生長至對數期的第3代細胞用于后續實驗。將細胞接種于6孔板(2×105個/孔)，常規培養，融合度達50%～70%時，分別轉染pcDNA3.1-KLF11及pcDNA3.1，操作參考Lipofectamine 2000試劑盒說明。采用Western blot法檢測未轉染細胞、轉染pcDNA3.1-KLF11或pcDNA3.1的細胞中KLF11蛋白的表達，確定轉染效果。KLF11一抗稀釋度1∶500，以GAPDH為內參。

1.3實驗分組實驗分4組。空白組：常規培養H9c2。H2O2組：采用200 μmol/L的H2O2處理H9c2細胞6 h。空質粒+H2O2組：pcDNA3.1轉染H9c2細胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2處理細胞6 h。KLF11+H2O2組： pcDNA3.1-KLF11轉染H9c2細胞48 h后，采用200 μmol/L的H2O2處理細胞6 h。

1.44組細胞活力的測定以1×104個/孔接種H9c2細胞于96孔板，細胞長至80%～90%時，按照1.3分組處理后，MTT法測定細胞活力。每孔加5 g/L的MTT試劑20 μL，37 ℃培養箱中孵育4 h，吸棄上清，每孔加入150 μL的DMSO室溫振蕩10 min，使結晶能夠充分溶解。用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度(A)，以A值反映細胞活力。每組設置5個復孔，實驗重復3次。

1.54組細胞凋亡率的檢測按照1.3分組處理細胞后，收集細胞，用PBS洗滌，以不含EDTA的胰蛋白酶消化1～2 min，待細胞由梭形皺縮變圓時，終止消化，吹打細胞成細胞懸液，收集于離心管中，4 ℃條件下1 000 r/min離心10 min，棄上清，PBS洗滌細胞。收集(1～5)×105個細胞，加1×Binding buffer 500 μL懸浮，再加5 μL的Annexin V-FITC及5 μL的 PI，混勻，室溫下避光反應5～15 min，1 h內上流式細胞儀檢測。每組設置3個復孔，實驗重復3次。

1.64組細胞中SOD活力及MDA含量檢測分組處理細胞后，采用SOD檢測試劑盒及MDA檢測試劑盒檢測細胞中SOD活力及MDA含量。實驗重復3次。

1.74組細胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2蛋白表達的檢測分組處理結束后，提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照4∶1的比例將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻于EP管中，煮沸變性5 min。每孔蛋白上樣40 μg，經SDS-PAGE分離，電泳后電轉PVDF膜，將膜用50 mL的50 g/L脫脂奶粉溶液于37 ℃封閉2 h。棄掉封閉液，加入經封閉液稀釋的一抗(1∶500稀釋的PI3K、p-AKT或Bcl-2抗體，1∶1 000稀釋的GAPDH抗體)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，加經封閉液稀釋的HRP標記的二抗(1∶2 000稀釋)，于37 ℃恒溫箱中孵育1 h，洗膜。暗室中ECL顯色、顯影。用Quantity One分析各蛋白條帶灰度值。以目的蛋白與內參條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達水平。實驗重復3次。

1.8統計學處理數據采用SPSS 21.0進行分析，3組間KLF11蛋白表達水平的比較，4組細胞活力、凋亡率、SOD活力、MDA含量、PI3K、p-AKT和Bcl-蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1轉染效果見圖1。未轉染細胞、pcDNA3.1轉染細胞和pcDNA3.1-KLF11轉染細胞中KLF11蛋白表達水平分別為(0.102±0.011)、(0.109±0.012)和(0.476±0.051)，3組比較差異有統計學意義(F=143.727，P<0.001);pcDNA3.1-KLF11轉染細胞KLF11蛋白表達高于未轉染細胞和pcDNA3.1轉染細胞(P<0.05)，說明pcDNA3.1-KLF11轉染效果顯著。

1、2、3：分別為未轉染細胞、pcDNA3.1轉染細胞和pcDNA3.1-KLF11轉染細胞

圖13組H9c2細胞中KLF11蛋白的表達

2.24組細胞活力和凋亡率的比較見表1。與空白組比較，H2O2組細胞活力降低，凋亡率增加；與H2O2組比較，KLF11+H2O2組細胞活力增加，凋亡率降低。

表1 4組細胞活力和凋亡率的比較

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.34組細胞SOD活力和MDA含量的比較見表2。與空白組比較，H2O2組細胞SOD活力降低，MDA含量增加；與H2O2組比較，KLF11+H2O2組細胞SOD活力增加，MDA含量降低。

表2 4組細胞SOD活力和MDA含量的比較

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

2.44組細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達水平的比較結果見圖2和表3。H2O2組細胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表達均較空白組降低，而KLF11+H2O2組細胞PI3K、p-AKT和Bcl-2表達較H2O2組升高(P<0.05)。

1、2、3、4：分別為空白組、H2O2組、空質粒+H2O2組、KLF11+H2O2組

圖2 4組H9c2細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達

*：與空白組比較，P<0.05；#：與H2O2組比較，P<0.05

3 討論

研究[7]表明，氧自由基(也稱ROS)參與多種心血管疾病的病理進程。ROS可由活化的心肌細胞、中性粒細胞等產生。當機體ROS過量產生時，可引起線粒體脂質過氧化，抑制線粒體功能，最終導致心肌ATP生成減少[8]，可引起心肌細胞損傷。此外，ROS過量產生還可導致細胞內DNA斷裂，破壞核酸，引起染色體畸變，最終導致細胞死亡[9]。有研究[10]發現，200 μmol/L的H2O2處理H9c2細胞，細胞存活率約為50%，提示該濃度H2O2能兼顧適量的細胞死亡率及氧化應激損傷，因此本研究中選擇該濃度為誘導劑量。

KLF11基因是KLF基因家族成員之一，在肝臟、肌肉、胰腺等多種組織中廣泛表達，參與細胞糖脂代謝、增殖等多種生理病理過程。目前對KLF11的研究多集中于腫瘤方面，在心血管方面的研究極少。有研究[11]顯示，KLF11對缺血損傷后的腦血管有保護作用，過表達KLF11可抑制小鼠心肌肥厚和纖維化[6]，提示KLF11在心血管疾病進程中有重要作用。本研究結果顯示，H2O2可誘導心肌細胞H9c2凋亡，提高其氧化應激水平，表現為細胞內SOD活力降低，MDA含量增加；而過表達KLF11可提高H2O2誘導的H9c2細胞中SOD活力，降低MDA含量。提示KLF11對心肌細胞損傷的保護作用與降低氧化應激水平有關。

PI3K/AKT是細胞內一條重要的信號途徑，廣泛參與細胞增殖、凋亡、分化等生物學過程的調控。AKT是PI3K下游的重要激酶，被磷酸化激活后可通過調節下游的一系列靶蛋白，參與細胞生物學過程的調控[12-13]。已有大量研究[14-15]表明，激活PI3K/AKT信號通路對心肌損傷有保護作用。本研究Western blot法檢測結果顯示，H2O2可降低H9c2細胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2的表達水平，而過表達KLF11可增強H2O2誘導細胞中PI3K、p-AKT和Bcl-2表達。提示KLF11可能通過激活PI3K/AKT信號通路，減弱氧化應激引起的心肌細胞損傷。

綜上所述，KLF11可減弱H2O2對H9c2細胞的活力抑制、凋亡促進作用，機制可能與抑制氧化應激和激活PI3K/AKT信號通路有關。KLF11可能是心血管疾病治療的有效靶點之一。