黑枸杞花青素提取工藝優化和含量測定

鞏芳芳，廖碧芳，董佳佳，于 斐，劉利娥，李文杰

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學化學與分子工程學院 鄭州 450001

花青素是普遍存在于深色植物中的一類水溶性天然色素，具有抗氧化、抗腫瘤、降低血栓形成風險等多種功能[1-2]，近年來引起諸多學者的關注。黑枸杞是傳統的中藥，成熟漿果呈現黑色，花青素含量極其豐富，是迄今為止發現的花青素含量最多的天然野生植物，是提取天然花青素的最佳原材料。但天然花青素化學結構缺少一個電子，極易受到活性氧基團和自由電子攻擊而降解，穩定性較差，不同pH、光照、氧、溶劑、溫度變化以及蛋白質和一些金屬離子都會引起花青素結構和組成發生變化，給花青素的提取帶來了很大的挑戰。

目前花青素的提取方法主要有有機溶劑提取、超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取和酶輔助法提取等。用正交實驗或響應面可對提取工藝進行優化。采用單一pH法、pH示差法[3-6]、差減法和高效液相色譜法等可對花青素含量和組分進行測定。正交實驗所需的實驗次數少，數據點分布均勻，但是無法找到因素和響應值之間明確的函數表達式。相較于正交實驗，響應面分析法得到的回歸方程精準度高，可以明確找到各因素的最佳組合和響應值的最優值。測定花青素的方法中，單一pH法和差減法操作簡單，但是準確率較低；高效液相色譜法準確率較高，但標準品昂貴且不穩定。本實驗以體積分數70%酸性乙醇為提取液，采用超聲波輔助法提取黑枸杞中的花青素，采用響應面法優化提取工藝，應用pH示差法測定花青素含量，并比較不同產地黑枸杞中花青素含量的差異，以期為天然產物的開發利用提供一定的理論指導。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑UV-1601分光光度計、UV-1000紫外可見分光光度計(北京華科儀科技股份有限公司)，高速粉碎機(廣州旭朗機械設備有限公司)，KQ-300DE型數控超聲波清洗器(寧波新芝生物科技股份有限公司)，電熱鼓風恒溫干燥箱(深圳大都工業有限公司)。氯化鉀(天津科密歐化學試劑有限公司)，醋酸鈉(北京康普匯維科技有限公司)，醋酸、體積分數95%乙醇、鹽酸(洛陽市昊華化學試劑有限公司)，實驗所用試劑均為分析純。黑枸杞產地分別為寧夏中衛和石嘴山，新疆阿克蘇、庫爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海德令哈、諾木洪和格爾木，內蒙古烏拉特前旗、額濟納旗和烏蘭察布，甘肅酒泉、敦煌、武威市和白銀，西藏拉薩、山南和日喀則。

1.2樣品前處理去除黑枸杞根部，置恒溫干燥箱中，60 ℃干燥至恒重后密閉冷卻，用高速粉碎機粉碎，過40目篩，收集后放置在具塞廣口瓶中密封避光保存。

1.3花青素的提取

1.3.1 提取工藝 稱取吐魯番黑枸杞粉末1 g，采用體積分數為70%的酸化乙醇提取。初步設定料(g)液(mL)比為1∶20，超聲波提取功率為50%，提取溫度為40 ℃，提取時間為20 min，保持其中3個因素不變，改變另一個因素。隨后取花青素提取液3 mL，5 000 r/min離心3 min。轉移上清至另一個離心管中，錫箔紙包裝，密封，放置在冰箱中冷藏。采用文獻[7]的方法分析料液比、超聲波提取功率、提取溫度和提取時間對黑枸杞中花青素提取率的影響，實驗重復3次。

1.3.2 優化方法 根據單因素實驗結果，選擇單因素最適濃度范圍，用Box-Behnken設計3因素3水平響應面優化實驗提取黑枸杞花青素。

表1 響應面因素水平

1.4花青素含量的測定

1.4.1 波長確定 將花青素提取液用UV-1601分光光度計在400～700 nm范圍內掃描，測定花青素提取液分別在pH 1.0和pH 4.5緩沖溶液中的吸光度，吸光度出現最大差值時所處的波長(525 nm)為測定的最佳波長。對于渾濁樣品，則需要同時測定樣品在700 nm處的吸光度[6]。

1.4.2 花青素含量的測定 取樣品提取液80 μL，分別加入pH 1.0的緩沖溶液和pH 4.5的緩沖溶液稀釋至8 mL，搖勻后置40 ℃的恒溫水浴鍋中平衡，pH 1.0的緩沖溶液平衡時間為30 min，pH 4.5的緩沖溶液平衡時間為20 min。隨后測定兩種不同pH提取液在525 nm和700 nm處的吸光值，按公式[4]計算花青素的提取率和含量，每個樣品測量3次，取均值。

2 結果

2.1花青素提取工藝的單因素結果見圖1。花青素提取率隨著提取溫度、提取時間、提取功率、料液比增大均呈現先上升后下降的趨勢。故在提取溫度30～50 ℃，提取時間20～30 min，提取功率為60%，料液比1∶20～1∶40范圍進行響應面實驗。

2.2花青素提取工藝優化的實驗結果根據單因素實驗結果，設計響應面優化實驗的因素和水平，結果見表2。

表2 響應面設計與結果

利用Design-Expert 軟件進行回歸擬合和方差分析，花青素提取率的回歸方程為：Y=1.71-0.041A+0.14B-0.029C+0.05AB-0.077AC+0.042BC-0.065A2-0.1B2-0.16C2。回歸模型的R2=0.951 6，RAdj=0.889 5，說明該模型與實際擬合程度較好。交互作用分析圖見圖2。從模型分析結果可知，一次項因素B、交互項AC和二次項A2、B2、C2對黑枸杞花青素提取率的影響顯著(F=55.200、8.031、6.081、14.960、35.202，P=0.001、0.025、0.043、0.006、0.001)。以上3個因素對花青素提取率的作用不是直接的線性關系，其對花青素提取率影響為提取時間>提取溫度>料液比。

通過回歸方程確定的最佳提取工藝為：提取溫度39.41 ℃，提取時間28.38 min，料液比1.00∶30.13。此條件下花青素提取率的理論值最大為1.755%。為方便實際操作，最佳提取工藝設定為提取溫度39 ℃，提取時間28 min，料液比1∶30。取6份等量的吐魯番黑枸杞粉末按最佳提取工藝進行實驗，平均提取率為1.701%，與理論值的相對誤差為3.17%，偏差較小。

A:料液比和提取溫度；B：提取時間和料液比；C：提取溫度和提取時間

2.3不同產地黑枸杞中花青素含量的測定西藏的山南和日喀則的黑枸杞中花青素的含量最高，分別為0.030 1和0.025 3 g/g。內蒙古的烏蘭察布、額濟納旗，甘肅的武威市和寧夏的石嘴山花青素含量也較高，分別為0.027 9、0.021 2、0.020 4、0.022 3 g/g。新疆的阿克蘇、庫爾勒、阿勒泰、喀什、吐魯番和哈密，青海的德令哈、諾木洪和格爾木，內蒙古的烏拉特前旗，西藏的拉薩和寧夏的中衛的黑枸杞中花青素含量較為平均，差異較小，分別為0.015 6、0.017 8、0.015 4、0.015 1、0.017 1、0.016 9、0.015 6、0.016 7、0.018 2、0.016 7、0.019 3、0.017 9 g/g。甘肅的酒泉、敦煌和白銀的花青素含量較低，分別為0.012 5、0.014 8、0.015 4 g/g。這可能是不同產地的氣候條件和土壤因素有差異，導致黑枸杞得到的光照、降水量和營養成分不同，對花青素的合成和積累造成影響。

3 討論

本實驗采用超聲輔助法提取黑枸杞中天然花青素，并對提取工藝進行響應面優化。得到提取花青素的最佳工藝為：提取溫度39 ℃，提取時間28 min，料液比1∶30，超聲功率60%。經驗證后，理論值與實際值的偏差較小，可用于實際樣品中天然花青素的提取。采用此工藝，對不同產地的黑枸杞中花青素進行提取和測定，結果表明黑枸杞中花青素的含量豐富，其中產自西藏的黑枸杞花青素含量最高，產自甘肅的黑枸杞花青素含量較低。導致差異的原因可能是西藏地區海拔較高，日照時間較長，晝夜溫差較大，土壤有機質沉積明顯，降水量分布都有利于黑枸杞的生長發育，使得黑枸杞中含有豐富的花青素；而甘肅的光照雖然充分，但其氣候干燥少雨，氣溫較低。相較而言，西藏的氣候和土壤條件更能滿足黑枸杞對水量和光照的要求，說明產地的氣候條件和土壤條件會對黑枸杞中花青素含量產生影響。本論文可為黑枸杞中天然花青素提取和開發利用提供一定理論依據。