煙草煙霧凝集物對BEAS-2B細胞氧化應激的影響

楊 薩，周洋洋，張佳彤，李中秋，于 琪，栗振凱，殷曉涵，張 巧

1)鄭州大學公共衛生學院衛生毒理學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學醫院疾病預防控制科 鄭州 450001

吸煙是一種影響居民健康的不良生活方式，中國目前擁有世界上最多的吸煙者[1]。煙草的使用是許多疾病病因中最主要的危險因素之一[2]。煙草燃燒可以產生超過6 000種的有毒有害物質，如自由基、焦油、尼古丁、多環芳烴等[3]。這些有毒有害物質大部分被機體吸入到肺部后停留在肺部，也有一小部分通過人體血液循環到達全身，因此香煙煙霧可以對機體呼吸系統、心血管系統、神經系統等多個系統造成損害，其中危害多集中在呼吸系統[4-7]。外界刺激物可使機體產生過多的活性氧(reactive oxygen species, ROS)，機體在正常生理條件下的氧化和抗氧化動態平衡被打破，從而發生氧化應激，進一步導致機體的病變[8]。研究[9]發現，超氧陰離子等強氧化劑大量存在于煙草煙霧中，可以在機體內經過一系列的生化反應產生ROS，而ROS因其化學屬性消耗抗氧化物從而對細胞和機體造成損傷。吸入煙草過程中產生的煙草煙霧在到達肺泡上皮細胞之前最先接觸支氣管上皮細胞，所以支氣管上皮細胞會率先受到損害。基于此，本研究采用急性染毒24 h的方法來探究煙草煙霧凝集物(cigarette smoke condensate, CSC)是否能夠通過氧化應激的方式對人正常支氣管上皮細胞BEAS-2B造成損傷，為進一步研究CSC的毒性作用機制以及預防和治療煙草煙霧引發的機體相關呼吸系統疾病提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞及試劑BEAS-2B細胞由新鄉醫學院公共衛生學院吳衛東教授惠贈。CCK-8(日本同仁化學研究所)，胎牛血清(美國Gemini公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，RPMI 1640培養基(北京索萊寶科技有限公司)，ROS檢測試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，丙二醛(MDA)檢測試劑盒(蘇州科銘生物科技有限公司)。

1.2CSC染毒液的制備CSC是由焦油含量為10 mg的某卷煙(鄭州煙草研究院)制成。分別用 Borgwaldt KCRM20H 轉盤吸煙機和92 mm 劍橋濾片抽吸和收集煙氣[3]，以DMSO(美國Sigma公司)為溶劑來萃取，得到 10 g/L的CSC母液，使用時用培養基進行稀釋。

1.3細胞存活率的測定采用CCK-8法。PBS洗細胞2次，每瓶加0.5 mL的胰蛋白酶進行消化，96孔板每孔接種100 μL細胞密度為1×105個/mL的細胞懸液，細胞貼壁后加10 μL染毒液/孔，使CSC最終濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14和0.16 g/L，設陰性對照孔和空白孔。染毒24 h后加入10 μL CCK-8/孔，37 ℃孵育4 h，酶標儀測450 nm處吸光度(A)值。細胞存活率=[(A染毒孔-A空白孔)/(A陰性對照孔-A空白孔)]×100%。實驗重復3次。

1.4細胞培養、染毒處理和形態學觀察將細胞放在37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中，用含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養基進行培養。全程必須保證無菌操作。空白對照組：用完全培養基培養細胞。DMSO溶劑對照組：完全培養基中加入0.08 g/L DMSO。CSC染毒組：細胞用完全培養基配制的0.02、0.04、0.06和0.08 g/L的CSC染毒液處理。培養24 h后用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態。

1.5細胞遷移距離的檢測采用細胞劃痕實驗。在6孔板底面均勻劃5條橫線。將細胞以1×106個/孔接種到6孔板上，細胞鋪滿瓶底時用200 μL槍頭垂直于背面橫線劃痕，PBS洗細胞2次后加無血清培養基，0、12、24和48 h后以6孔板背面所劃的橫線與劃痕垂直的位置為觀測點進行觀察拍照，每組選取10張圖片，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析遷移距離。某時間點細胞的遷移距離為該時間點與0 h劃痕間距差值的絕對值。實驗重復3次。

1.6細胞ROS水平測定細胞按1.4分組、染毒24 h后，1 000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀。用DCFH-DA(無血清培養基1∶1 000稀釋)重懸細胞，每5 min混勻1次，共染色20 min。用激光共聚焦顯微鏡和熒光酶標儀檢測熒光強度(激發光波長488 nm，發射光波長525 nm)。實驗重復3次。

1.7細胞MDA含量測定細胞按1.4分組、染毒24 h后，用含PMSF的RIPA裂解液冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×g離心15 min，收集上清液，BCA法定量。每組取30 μg蛋白，補足體積至100 μL，加0.3 mL試劑一后顛倒混勻。95 ℃水浴30 min后冰上冷卻，1 000×g離心10 min后取上清200 μL，于96孔板中測定A532 nm和A600 nm,計算ΔA，根據說明書計算MDA含量。實驗重復3次。

1.8細胞SOD活性測定細胞按1.4分組、染毒24 h后，冰上裂解20 min，4 ℃離心15 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。按SOD活性檢測試劑盒說明書進行操作。實驗重復3次。

1.9統計學處理采用SPSS 17.0對數據進行分析。不同組間細胞內ROS水平、SOD活性和MDA含量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同組間不同時間點細胞遷移距離的比較采用重復測量數據的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1CSC暴露對BEAS-2B細胞形態和功能的影響

2.1.1 染毒濃度的確定 CCK-8實驗結果見圖1。由圖1可知，CSC以劑量依賴性的方式降低BEAS-2B細胞的活力；當CSC濃度為0.08 g/L時，BEAS-2B細胞存活率為56.9%，因此選擇0.02、0.04、0.06和0.08 g/L為CSC染毒的終濃度以確保在接下來的研究中細胞活力不會低于50%。

倒置顯微鏡下可見DMSO溶劑對照組細胞及細胞核的形態與空白對照組相比無明顯差異；與DMSO溶劑對照組相比，0.02 g/L CSC染毒組少數細胞內出現空泡，0.04 g/L CSC染毒組細胞發生腫脹，一些細胞的細胞核變形增大甚至出現畸形，0.06 g/L CSC染毒組細胞的細胞膜間出現針刺樣突起改變，0.08 g/L CSC染毒組細胞體積明顯增大，結構發生崩解，細胞膜和細胞核輪廓模糊，部分細胞核碎裂。見圖2。

圖1 CSC暴露后BEAS-2B細胞存活率的變化

A:空白對照組；B：DMSO溶劑對照組；C～F:分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L CSC染毒組

2.1.2 細胞遷移能力檢測 結果見表1。與空白對照組、DMSO溶劑對照組細胞相比，各濃度CSC染毒組細胞的遷移距離均增加。

2.2各組BEAS-2B細胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較各組細胞熒光強度激光共聚焦顯微鏡觀察結果見圖3，細胞內ROS熒光信號強度隨著CSC染毒濃度的增加而增強。各組細胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較見表2。

表1 各組細胞不同時間點遷移距離的比較(n=3) mm

FCSC=105.340，P<0.001；F時間=793.520，P<0.001；F交互=24.555，P<0.001；*：與空白對照組、DMSO溶劑對照組相比，P<0.05

A:DMSO溶劑對照組；B：空白對照組；C～F:分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L CSC染毒組

表2 各組細胞ROS水平、MDA含量和SOD活性的比較(n=3)

*：與空白對照組、DMSO溶劑對照組相比，P<0.05；#：與0.02、0.04 g/L CSC染毒組相比，P<0.05

3 討論

煙草煙霧是一種成分非常復雜的混合物，其中含有大量對機體有害的物質，可以導致多種與呼吸相關的疾病，如慢性阻塞性肺疾病和哮喘等[10-12]。有研究[13]表明煙草煙霧引起的氧化應激是主要的發病機制。研究[14]表明，煙草煙霧可使人肺成纖維細胞發生氧化應激并造成遺傳學損傷。支氣管上皮細胞是外界環境與氣道接觸的首道防線，不但可以作為合成、釋放許多細胞因子和炎性介質的效應細胞參與免疫反應和氣道炎癥，還是各種炎性介質等作用的靶細胞。因此，本研究使用CSC對BEAS-2B細胞進行染毒來觀察CSC對BEAS-2B細胞氧化應激的影響。采用CCK-8法檢測細胞活力，發現CSC可降低細胞存活率，并存在劑量-效應關系，為保證細胞存活率達到50%以上，故選用0.02、0.04、0.06和0.08 g/L作為CSC染毒濃度干預細胞24 h進行后續實驗。

研究結果顯示，0.02 g/L CSC染毒組BEAS-2B細胞內有空泡出現，隨著CSC染毒濃度的增加，BEAS-2B細胞發生腫脹，輪廓也逐漸由清晰變得模糊，部分細胞核變形、增大甚至出現畸形，細胞膜的邊緣出現許多針刺樣突起，0.08 g/L CSC染毒組BEAS-2B細胞出現了核碎裂。同時，CSC改變了BEAS-2B細胞的遷移能力，染毒組細胞遷移距離高于空白對照組、DMSO溶劑對照組。這些結果表明CSC對BEAS-2B細胞具有細胞毒性作用。

MDA是一種脂質過氧化產物，當機體對過量產生的ROS不能及時清除時，其會使生物膜上發生脂質過氧化反應，產生的MDA會使機體細胞膜流動性和通透性發生改變，這將會造成機體細胞結構和功能的變異。因而，MDA的含量一方面可直接反映細胞發生脂質過氧化反應的強度和速率，另一方面也能夠間接地反映細胞過氧化損傷的程度。研究[15]發現，煙草煙霧是一種有效的氧化劑，一次抽吸動作可產生1×1017個氧化物分子。此外，研究[16]發現香煙煙霧暴露可通過氧化應激誘導卵泡破壞和卵母細胞功能障礙。在本研究中，BEAS-2B細胞內ROS水平隨著CSC染毒濃度的升高逐漸增高。DMSO溶劑對照組ROS水平和MDA含量與空白對照組比較差異無統計學意義；CSC染毒后，BEAS-2B細胞內ROS水平和MDA含量增高，并隨CSC濃度增加而增高。

SOD是機體內清除自由基的主要抗氧化酶。ROS生成增多可以誘導細胞內抗氧化酶類的產生，對過量產生的ROS進行消除，來抵抗氧化損傷對細胞的危害，從而保護細胞。因此，SOD活性可代表細胞的抗氧化損傷能力，SOD活性降低，細胞的氧化損傷就會加重。本研究中BEAS-2B細胞內SOD活性隨著CSC染毒濃度的增加而逐漸降低。以上結果說明CSC染毒后BEAS-2B細胞內的氧化平衡狀態被打破，細胞受到損傷，與以往報道[17]結果一致。

綜上所述，CSC對BEAS-2B細胞具有細胞毒性，能夠以劑量依賴性的方式抑制細胞的活力并改變細胞形態。同時，CSC能夠提高BEAS-2B細胞內ROS水平，加劇過氧化反應，生成大量的MDA，降低細胞內抗氧化酶SOD的活性，從而導致氧化應激的發生，對細胞造成損傷。