食管癌小鼠食管組織中IL-17信號通路相關因子mRNA的表達

郭夢醒，鄭雨佳，唐 博，張 毅，黃 嵐

1)鄭州大學第一附屬醫院生物細胞治療中心 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院腫瘤中心 鄭州 450052 3)河南省腫瘤免疫和生物治療重點實驗室 鄭州 450052

我國是食管癌發病大國[1-2]。食管癌的發生可能與遺傳、環境及生活方式等多種因素有關，但確切的發病機制尚未闡明。越來越多的研究[3-6]表明，腫瘤微環境中的免疫細胞、成纖維細胞、結構分子和炎性細胞因子可促進食管癌的發生發展。CD4+T細胞在活化和擴增后，分化為產生不同細胞因子和效應功能的Th1、Th2和Th17細胞亞群[7]。促炎細胞因子白細胞介素-17(interleukin-17，IL-17)主要由Th17細胞產生，是該家族的標志性細胞因子[8]。IL-17在人類多種腫瘤中發揮重要作用，但在食管癌變中的作用仍存在爭議[9]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4-NQO)是一種誘癌劑，可誘導C57BL/6J小鼠發生食管癌變[10]。本研究采用4-NQO飲水法建立小鼠原位食管癌模型，應用qRT-PCR檢測小鼠食管組織中IL-17、IL-1β、IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13 mRNA的表達，探討IL-17信號通路在食管癌發生中所發揮的作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物、主要材料和試劑13只8周齡C57BL/6J雄性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；4-NQO購自美國Sigma-Aldrich公司；1，2-丙二醇購自天津市科密歐化學試劑有限公司；RNAiso Plus和反轉錄試劑盒均購自TaKaRa公司；SYBR Green購自Roche公司；IL-17、IL-23、IL-1β、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。

1.2小鼠食管癌模型的建立和分組將4-NQO溶于1，2-丙二醇配制成濃度為5 g/L的液體，再用高壓滅菌水將4-NQO稀釋成終質量濃度為100 mg/L的溶液。將13只8周齡C57BL/6J雄性小鼠分為兩組，4-NQO組(n=8)飲用含100 mg/L 4-NQO的滅菌水。對照組(n=5)飲用含1，2-丙二醇的滅菌水。每周新鮮制備誘癌劑，更換小鼠飲用水。10周后改為飲用滅菌水，繼續飼養18周，每周監測小鼠體重，觀察小鼠生長狀況，活動狀態等。

1.3食管組織病理學檢查采取頸椎脫臼法處死小鼠后進行解剖，打開胸腔，迅速取出小鼠食管組織，放入體積分數4%甲醛溶液中固定，脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察。

1.4食管組織中IL-17、IL-1β、IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13mRNA的qRT-PCR檢測剪取大小適中的食管組織，加入RNAiso Plus在組織勻漿儀中破碎，從組織勻漿裂解液中提取RNA，經反轉錄cDNA和PCR擴增，擴增條件為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，40個循環。引物序列見表1，以GAPDH為內參基因，以2-ΔΔCt計算出每個目的基因mRNA的相對表達量。

表1 引物名稱及序列

續表1

1.5統計學處理采用SPSS 21.0進行數據分析，應用重復測量數據的方差分析比較兩組小鼠體重變化的差異，應用兩獨立樣本的校正t檢驗比較兩組小鼠IL-17通路相關因子mRNA表達水平的差異，應用Pearson相關分析4-NQO組中IL-17與其通路中相關因子mRNA的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1兩組小鼠體重變化結果見表2。

表2 兩組小鼠體重變化 g

F組間=23.527,P<0.001;F時間=93.324,P<0.001;F交互=21.237,P<0.001

2.2兩組小鼠食管組織病理學觀察結果見圖1。4-NQO組小鼠食管組織出現增生、炎癥等改變，黏膜上皮增厚；細胞異型性明顯，體積偏大，形狀、排列均不規則，細胞極性紊亂。

2.3兩組小鼠組織IL-17信號通路相關因子mRNA表達水平結果見表3。

A：對照組；B：4-NQO組

表3 兩組小鼠食管組織中IL-17信號通路相關因子mRNA表達水平的比較

2.44-NQO組小鼠食管組織中IL-17與其他因子的相關關系4-NQO組小鼠食管組織中IL-17 mRNA與IL-23、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9和MMP-13 mRNA的表達呈正相關(r=0.918、0.909、0.725、0.924、0.941、0.940和0.943，P均<0.05)。

3 討論

食管癌的病因和發病機制復雜，至今仍未被完全闡明。揭示食管癌發生的關鍵機制，有助于為患者的早期診斷與治療提供新的靶點。作者前期的研究[11]發現IL-17通過STAT3/NFκB/Notch1信號轉導通路促進非小細胞肺癌的進展，但是在食管癌中的作用尚未闡明。本研究建立小鼠原位食管癌模型，探討IL-17信號通路相關因子在食管癌發生過程中的作用。

不同的腫瘤微環境中IL-17發揮不同的作用。研究[12]發現在敲除IL-17的小鼠中，一些腫瘤生長更快，而一些腫瘤生長更慢，提示IL-17發揮抗腫瘤作用還是促腫瘤作用與腫瘤的微環境關系密切。Dowell等[13]發現，在膀胱癌中IL-17通過上調IL-8的表達和增加中性粒細胞的招募從而發揮抗腫瘤效應。但也有研究[14]報道IL-17在原發性肝癌中高表達，推測其參與了肝癌的癌變過程。最近的研究[15]發現結腸微生物群的特定成員可促進結腸黏膜中IL-17的產生從而促進癌變發生。

L-23和IL-1β可促進Th17細胞分化及IL-17的產生，IL-17通過誘導CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9等因子的產生促進炎癥和癌癥的發生發展[16]。本研究結果顯示IL-17 mRNA在4-NQO組小鼠食管組織中表達升高。進一步檢測發現IL-23、IL-1β、CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9及MMP-13 mRNA在4-NQO組小鼠食管組織中均高表達，說明IL-17信號通路在促進食管癌發生中發揮作用。本研究還發現4-NQO組小鼠食管組織中IL-17 mRNA與 CXCL1、CXCL2、S100A8、S100A9、MMP-9、MMP-13 mRNA的表達呈正相關，提示IL-17在促進食管癌變中發揮作用可能與這些細胞因子有關。腫瘤微環境中活化的樹突狀細胞產生IL-23和IL-1β，刺激初始的CD4+T細胞分化為Th17細胞和IL-17的產生，Th17可能參與了食管鱗癌的浸潤轉移過程，并與不良預后相關[17-19]。另有研究[20]報道炎性細胞因子可促進上皮細胞分泌趨化因子，招募中性粒細胞，形成正反饋產生更多趨化因子，引起更加廣泛的損傷，促進腫瘤發生；微環境中的間質細胞可以通過趨化因子促進腫瘤生長和轉移。S100鈣結合蛋白家族在腫瘤細胞和基質細胞之間發揮作用，促進炎性腫瘤微環境的形成，從而促進原發性腫瘤生長和轉移[21]。MMPs是一類分泌蛋白酶，參與組織重塑、血管生成及腫瘤侵襲和轉移。MMP-9在食管癌中表達升高，與淋巴結轉移和浸潤深度有關[22]。

綜上所述，本研究提示IL-17信號通路可能通過趨化因子的產生、炎性腫瘤微環境的形成和組織重塑，促進食管癌的發生。