拉坦前列素和毛果蕓香堿對DBA/2J小鼠房水動力學及眼壓控制作用的研究△

邢超 高常青 雷苑 孫興懷

(1.復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院眼科 上海 200031；2.中南大學湘雅三醫院實驗動物中心 長沙 410013)

青光眼是僅次于白內障的全球第二大致盲性眼病，衰老是青光眼的“強烈高危誘因” (strong risk factor)[1-2]。隨著全球人口老齡化，預計到2020年全球青光眼患者將達8 000萬[3]，其中約有800萬的患者將會失明。我國50歲以上人群原發性青光眼患病率為2.1%，致盲率高達10%。增高的眼壓通過機械壓迫和引起視神經缺血2種機制導致視神經損害。降眼壓是目前臨床治療青光眼最有效的方法。臨床使用的降眼壓藥物是通過3種機制實現眼壓下降的，包括促進經典或非經典通路房水引流(如毛果蕓香堿、ROCK抑制劑和拉坦前列素等)，減少房水分泌(如β受體阻滯劑等)。目前降眼壓效果最好的前列素衍生物類藥物主要是通過增加非經典通路，即葡萄膜/鞏膜途徑的房水外流來降眼壓的，但是通過該通路的房水僅占房水總外流量的4%～17%[4]。 絕大部分(83%～96%[5]) 的房水則是由經典房水外流通路 —— 經小梁組織和Schlemm管(SC)流出眼球進入體循環。

DBA/2J小鼠作為一種重要的青光眼動物模型，用于研究高眼壓相關的進行性視網膜神經節細胞(retinal ganglial cell，RGC)減少、視神經變性和青光眼視功能障礙[6-8]。虹膜基質萎縮是由于酪氨酸相關蛋白1b突變(Tyrp1b)造成的，虹膜色素分散是由編碼跨膜糖蛋白基因GpnmbR150X的未成熟停止密碼子突變引起的[6,9]。DBA/2J小鼠在3～4月齡時，會出現邊緣虹膜缺損，瞳孔邊緣色素分散和虹膜增厚[6]。分散的色素可進入前房，并逐漸在小梁網中聚積，從而阻礙了房水的流動，導致眼壓升高。在6～9月齡眼壓達到最高值[6-7]。10～12月齡小鼠出現RGC損失和視覺功能障礙，最終失明[6]。

然而，作為重要青光眼模型的DBA/2J小鼠，其房水動力學基本參數尚不明確，常用青光眼藥物對其降眼壓的效果亦罕見報道。因此，本研究擬測量DBA/2J小鼠的經典通路房水外流系數，以及選擇常用青光眼藥物拉坦前列素(通過非經典路徑促進房水外流)和毛果蕓香堿(通過經典路徑促進房水外流)在其不同月齡段的降眼壓效果，來評價不同降眼壓藥物實驗研究的適當動物模型。

1 材料與方法

1.1 動物 本實驗采用3月齡及10月齡的C57BL/6小鼠和DBA/2J小鼠，分別用0.5%毛果蕓香堿或0.005%拉坦前列素2種藥物滴右眼(干預眼)，左眼滴磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(對照眼)，給藥2周。共8個實驗組，8只/組，共128眼。C57BL/6小鼠作為本研究的對照品系，由于其品系穩定且易于繁殖，廣泛用于青光眼等疾病模型的建立[10-11]及其藥物機制[12]的研究。所有動物實驗規范都依照ARVO的聲明進行。小鼠飼養在白色塑料籠盒里，在12 h/12 h的明暗交替的環境中使用標準的小鼠糧飼喂。DBA/2J小鼠最初是從杰克遜實驗室購得，C57BL/6小鼠從上海南方模式生物研究中心購得。

1.2 藥品 本研究使用2種降低眼壓的藥物，分別為毛果蕓香堿 (硝酸毛果蕓香堿滴眼液，5 mL∶25 mg，山東博士倫福瑞達制藥有限公司) 和拉坦前列素(拉坦前列素滴眼液, 25 mL∶125 μg，輝瑞制藥，比利時)。毛果蕓香堿每天眼表給藥2次(分別在上午9時和下午5時)，每次1滴；拉坦前列素每天眼表給藥1次(上午9時)，每次1滴。將藥物滴于右眼共2周；左眼作為自身對照，給予PBS同樣滴藥。

1.3 眼壓測量 實驗對3、10月齡的小鼠雙眼眼壓進行測量。用動物專用眼壓計 (Tonolab，Icare)測量眼壓，每只眼重復測量2次，最終眼壓取2次平均值。

1.4 房水動力學測量 鼠眼按既定的方法灌注[13]。實驗研究小鼠的眼睛在處死后10 min內摘除并保存在DMEM培養基中直到灌注。 首先將摘除的眼球固定在支架上，用33 G斜尖納米針套管針安裝在一個連有玻璃注射器(50 μL, Hamilton, UK)的泵上進行小鼠眼前房灌注。運用電腦控制注射器泵，將可變流量(Q)輸送到前房，以維持所需的眼壓(壓力傳感器Honey well, model 142PC1G)。在恒定壓力(P)為8、15、22 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的條件下，用PBS(Invitrogen, UK)對眼球進行灌注，每個壓力水平至少灌注20 min。由于是對摘除的眼球進行灌注，為獲得相應的體內眼壓，需在灌注壓力中加上鞏膜外靜脈壓力，如8 mmHg灌注壓大約相當于13～18 mmHg體內壓[14-16]。軟件以10 Hz的頻率測量流量和壓力，每10 s電子記錄1次。房水流暢系數(C) =流量(Q) /壓力(P)。假設在平衡狀態下，總流入量等于總流出量，眼球的鞏膜壓力等于0。通過對3種不同壓力 (8、15、22 mmHg)的流量與壓力之間的關系進行線性回歸分析，計算出經典通路房水流暢系數。

1.5 前房角組織形態 選擇在恒壓(8 mmHg)時，注入4%多聚甲醛固定眼球，并保存在4%多聚甲醛中(1～3個月)，然后處理石蠟嵌入，切片(7 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色。切片用標準光學顯微鏡觀察 (Leica, 美國)。

1.6 統計學處理 使用Mann-WitneyUtest (SPSS 16, Chicago)分析數據。當P<0.05，差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥理學實驗

2.1.1 毛果蕓香堿 對于3月齡小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果蕓香堿后眼壓比對照眼顯著降低了2.0 mmHg(n=8，P<0.05)；而DBA/2J小鼠眼壓降低了2.6 mmHg (n=8，P<0.05，圖1A)。對于10月齡小鼠，C57BL/6小鼠使用毛果蕓香堿后眼壓顯著下降了3.0 mmHg(n=8，P<0.05)，DBA/2J小鼠眼壓未顯著下降(降幅僅為1.3 mmHg ，n=8，P>0.05，圖1B)。

2.1.2 拉坦前列素 對于3月齡C57BL/6小鼠，使用拉坦前列素后眼壓顯著下降(n=8，P<0.05，圖1C，圖2)。對于10月齡小鼠，雖然拉坦前列素仍顯著降低了DBA/2J小鼠的眼壓, 但是眼壓降幅從3月齡時的29.1%下降到15.6%(n=8，P<0.05，圖1D)。

圖1. 3月齡、10月齡DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠用藥前后眼壓變化

在使用毛果蕓香堿后，3月齡DBA/2J和C57BL/6小鼠眼壓降幅較為相似(分別為13.8%和16.5%)，而10月齡DBA/2J小鼠眼壓下降幅度僅為同月齡C57BL/6小鼠的32%。使用拉坦前列素后，3月齡DBA/2J小鼠眼壓降幅是C57BL/6小鼠的74%，10月齡小鼠其眼壓降幅百分比縮小到68%(圖2)。

藥理學實驗研究了2種青光眼藥物(毛果蕓香堿和拉坦前列素)對3月齡、10月齡的DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠的降眼壓效果，實驗發現拉坦前列素的降眼壓效果有年齡依賴性。

2.2 基礎房水動力學參數 10月齡、12月齡的DBA/2J小鼠的眼壓分別為(17.3±2.4)mmHg、(17.7±2.1)mmHg，顯著高于同月齡C57BL/6小鼠的眼壓(11.3±1.1)mmHg和(13.2±1.3)mmHg(圖3A)。本實驗僅選用3月齡和10月齡小鼠進行研究。DBA/2J小鼠的房水流出系數為0.004 1 μL·min-1·mmHg-1，顯著低于正常C57BL/6小鼠的房水流出系數0.006 8 μL·min-1·mmHg-1(圖3B)。10月齡DBA/2J小鼠與10月齡正常C57BL/6小鼠前房角形態見圖4。對比發現DBA/2J小鼠虹膜分散的色素附著于其小梁網上。

圖2. 對比3月及10月齡2種小鼠在2種藥物作用下眼壓下降百分比

圖3. 正常DBA/2J小鼠和C57BL/6小鼠眼壓(A)、房水動力學(B)參數變化

圖4. 10月齡正常C57BL/6(A)小鼠和DBA/2J(B)小鼠前房角形態。光鏡下前房角組織形態對比，HE染色 ×200

3 討論

DBA/2J小鼠攜帶2種自發的基因突變，可發展成虹膜基質萎縮和虹膜色素分散。其視網膜和視神經退化癥狀與人類的慢性青光眼相似[17]。本研究報道了DBA/2J小鼠作為研究青光眼發病機制與治療策略研發的重要模型，其房水動力學特征及對2種臨床常用降眼壓藥物(拉坦前列和毛果蕓香堿)的反應。

在DBA/2J小鼠上，毛果蕓香堿的降眼壓作用與小鼠年齡高度相關。對于3月齡小鼠，毛果蕓香堿能顯著降低DBA/2J 與C57BL/6小鼠的眼壓。而對于10月齡的DBA/2J小鼠，拉坦前列素仍可以顯著降低其眼壓，但毛果蕓香堿失去了降眼壓作用。

毛果蕓香堿在DBA/2J小鼠上所呈現的年齡相關性可能與該小鼠的特性及2種藥物的作用機制有關。毛果蕓香堿是一種具有直接作用的擬膽堿藥物，可直接刺激位于瞳孔括約肌、睫狀體及分泌腺上的毒蕈堿受體，通過收縮瞳孔括約肌，使其周邊虹膜離開房角前壁，開放房角，增加房水排出。同時還通過收縮睫狀肌的縱行纖維，增加鞏膜突的張力，使小梁網間隙開放，房水引流阻力減小，增加房水排出，從而降低眼壓。3月齡的DBA/2J小鼠，其虹膜彈性較好，紋理清，無色素脫失、無萎縮，毛果蕓香堿能夠通過其作用機制降低眼壓。而對于10月齡的DBA/2J小鼠，其虹膜老化，色素分散、脫失，阻塞小梁網。這可能是導致毛果蕓香堿降眼壓作用失效的原因。

拉坦前列素是前列腺素F2α(PGF2α)的類似物,對前列腺素類受體具有高度選擇性,通過增加葡萄膜鞏膜的房水外流而降低眼壓。也有文獻[18]報道拉坦前列素也可通過經典通路降低眼壓，通過光學相干層析成像測量人眼Schlemm管內徑，用藥后內徑顯著擴大。雖然10月齡的小鼠虹膜老化，色素分散，阻塞小梁網，但是拉坦前列素仍能通過上述途徑降低眼壓。所以，雖然其降眼壓效果較3月齡DBA/2J小鼠有所下降，但仍有顯著降眼壓效果。

有文獻[19]報道，在單次局部使用拉坦前列素后，眼壓在8～12 h下降到最大，24 h內眼壓低于預處理水平。本研究眼壓的測量在該藥物的起效時段內，未發現延遲效應，且該藥物在DBA/2J小鼠上的作用效果與臨床上觀察到的色素性青光眼作用效果一致[20-21]。

綜上所述，DBA/2J小鼠作為青光眼模型，由于其虹膜色素分散、脫離等特點，并非適合所有降眼壓藥物的篩選，特別是通過經典通路降眼壓的藥物。