高效液相色譜法測(cè)定食品中脫氫乙酸含量的方法優(yōu)化

□吳寧寧 高運(yùn)通

脫氫乙酸及其鈉鹽，作為常用食品防腐劑代表，被廣泛應(yīng)用于果蔬汁、糕點(diǎn)、醬菜等，以高效、低毒、廣譜而著稱，對(duì)酵母菌、霉菌具有較強(qiáng)的抑菌能力，但脫氫乙酸及其鈉鹽能夠快速被人體吸收，分散在器官與血液中，對(duì)多種氧化酶具有一定的抑制作用，影響人體健康，為此食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)不同種類食品中脫氫乙酸及其鈉鹽的含量限值進(jìn)行了明確規(guī)定，其允許添加的最大限值為1.0g/kg。國(guó)標(biāo)GB5009.121-2016規(guī)定了脫氫乙酸含量檢測(cè)方法，其中氣相色譜法方法比較復(fù)雜，重復(fù)性差，影響因素多，故常用高效液相法對(duì)食品中脫氫乙酸及其鈉鹽進(jìn)行含量測(cè)定，但按照國(guó)標(biāo)方法提供的液相條件進(jìn)行檢測(cè)，色譜峰拖尾嚴(yán)重，前處理過(guò)程復(fù)雜，為此筆者對(duì)樣品前處理及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)優(yōu)化色譜峰拖尾有了明顯的改善、前處理過(guò)程更加簡(jiǎn)單快捷。

一、主要儀器設(shè)備和試劑

高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，配備二極管陣列檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器)、離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，轉(zhuǎn)速4,000r/min)、分析天平(上海天美天平儀器有限公司，靈敏度0.001g)；甲醇(默克，色譜級(jí))、磷酸(國(guó)藥，優(yōu)級(jí)純)、乙酸銨(阿拉丁，色譜級(jí))；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(準(zhǔn)確稱取脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g(精確至0.0001g)于100mL容量瓶中,用10mL氫氧化鈉溶液(10.2.2)溶解,用水定容至刻度，備用)。

二、測(cè)定方法

(一)樣品的制備與提取。稱取均質(zhì)后的樣品2g(精確至0.001g)，置于50mL離心管內(nèi)，依次加入10mL甲醇和10mL水，超聲提取30min后，冷卻至室溫后加亞鐵氰化鉀溶液1mL和乙酸鋅溶液1mL，加水定容至25mL，4,000r/min離心5min，上清液過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾后，供高效液相色譜儀測(cè)定。

(二)色譜條件。色譜柱：C18(250mm×4.6mm,5.0μm)；紫外或二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：293nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；柱溫：30℃；流動(dòng)相：1.甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90)，2.甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)。

(三)試驗(yàn)結(jié)果。

1.優(yōu)化流動(dòng)相。脫氫乙酸的羧基結(jié)構(gòu)易于C18色譜柱中硅羥基結(jié)構(gòu)發(fā)生反應(yīng)，形成氫鍵，為此通過(guò)改變流動(dòng)相的PH來(lái)確定合適的流動(dòng)相及其比例，通過(guò)多次試驗(yàn)，采用甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)作為此次優(yōu)化試驗(yàn)的流動(dòng)相，對(duì)比國(guó)標(biāo)GB5009.121-2016中的流動(dòng)相，進(jìn)行試驗(yàn)如下。

吸取脫氫乙酸貯備液適量，至5mL容量瓶中，加水至刻度，配制成濃度為100μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別在流動(dòng)相1——甲醇+0.02mol/L乙酸銨(10+90)；流動(dòng)相2——甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)，兩種色譜條件下進(jìn)行測(cè)定：以流動(dòng)相1進(jìn)行檢測(cè)，圖譜如圖1所示。

圖1

以流動(dòng)相2進(jìn)行檢測(cè)，圖譜如圖2所示。

圖2

通過(guò)譜圖1、2比對(duì)，流動(dòng)相2：甲醇+0.1%磷酸水溶液(55+45)，色譜峰拖尾明顯改善，故選用流動(dòng)相2。

2.線性。分別吸取脫氫乙酸貯備液適量，至5mL容量瓶中，加水至刻度，配制成濃度為1.00μg/mL、10.0μg/mL、50.0μg/mL、100μg/mL、200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機(jī)測(cè)定，相關(guān)系數(shù)為0.9998，線性方程為：y=35.47270x+34.45627。

圖3

3.精密度及回收率。取空白試樣36份，每6份加入同一濃度的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，分別按照前處理及色譜條件(流動(dòng)相2)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1

4.檢出限。稱取空白試樣3份，加入一定量的脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，使其濃度在0.002g/kg，按照優(yōu)化好的前處理及其色譜條件進(jìn)行測(cè)定，目標(biāo)成分脫氫乙酸信噪比大于3，表明儀器滿足該方法檢出限0.002g/kg。

三、結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)在國(guó)標(biāo)GB5009.121-2016的基礎(chǔ)上對(duì)樣品前處理及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，將前處理過(guò)程簡(jiǎn)單化，采用超聲提前樣品中目標(biāo)成分，亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液沉淀蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)；色譜條件中對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行了調(diào)整，由原來(lái)的乙酸銨更改為磷酸水溶液。優(yōu)化后的方法前處理過(guò)程更加簡(jiǎn)單快捷，回收率90%以上，線性相關(guān)系數(shù)0.99987，重復(fù)性良好(RSD<0.6%)，方法檢出限為0.002g/kg,色譜峰拖尾明顯改善,可在某些食品檢測(cè)系統(tǒng)中推廣應(yīng)用。