文山牛Y染色體遺傳多樣性與父系起源研究

亐開興， 王凱悅， 張繼才， 黃必志， 陳寧博， 馮光杰， 李順東， 陳 宏， 雷初朝*

(1.云南省草地動物科學研究院，昆明 650212；2.西北農林科技大學動物科技學院，陜西 楊凌 712100；3.云南谷多農牧業有限公司，云南 廣南 663300)

文山牛又名文山高峰牛，屬役肉兼用型地方黃牛品種，主要分布于云南省文山壯族苗族自治州的文山、硯山、西疇、麻栗坡、馬關、丘北、廣南、富寧八縣，其中廣南、富寧、丘北、硯山等縣海拔900 m以上、旱地面積較大的地區分布較多，以廣南、富寧兩縣結合部的百樂—坡油一帶的文山牛最為出名[1]。文山牛體軀結實勻稱，力大耐勞，繁殖力較強，性情溫順，能適應干燥寒冷和潮濕炎熱的氣候，是一個優良的役用地方黃牛品種，并具有較好的肉用性能[2]。

Y染色體單倍型頻率和地理分布可以提供有關遷徙、雄性基因流以及系統發育關系等信息[3]，因此，Y染色體特異性標記已被廣泛用于研究人類與動物的父系起源。近年來，基于Y染色體單核苷酸多態性標記(Y—SNPs)研究結果，定義了普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組，以及一個新的Y1.2單倍型組[4-6]。常振華等[7]利用Y—SNP標記，發現中國黃牛以Y2和Y3單倍型組為主，Y2單倍型組在北方牛群體中占優勢，Y3單倍型組在南方牛群體中占優勢。而關于家牛Y染色體STR變異研究，Edwards等[8]首先評估了4個Y-STR特異性標記在家牛以及相關物種中的遺傳多態性。隨后，Cai等[9]研究發現2個Y—STR位點(UMN2404和UMN0103)可用于區分普通牛和瘤牛血統。近年來，國內外越來越多的研究已經將二者結合起來分析黃牛群體的Y染色體單倍型結構和父系起源歷史[10-11]。Xia等[12]分析了34個中國黃牛品種/群體的Y—SNPs和Y—STRs多態性，結果表明中國黃牛存在豐富的父系遺傳多樣性，并且可能擁有許多起源于近東馴化中心的原牛血統。

我國幅員遼闊，自然環境復雜多樣，孕育了十分豐富的黃牛遺傳資源，到目前為止，大多數關于文山牛品種遺傳多樣性的研究主要集中于線粒體水平。文際坤等[13]通過分析線粒體DNA限制性片段長度多態性(mtDNA RFLP)，表明文山牛同時具有普通牛和瘤牛母系起源，以瘤牛血統為主。隨后，錢林東等[14]測定了文山牛mtDNA D—loop區全序列并對其群體遺傳變異進行分析，結果同樣支持云南文山牛具有普通牛和瘤牛兩種母系血統來源。然而，關于文山牛Y染色體遺傳多樣性及父系起源的研究較少。Gou等[15]通過比較文山牛的線粒體控制區和Y染色體基因片段，線粒體數據表明，文山牛存在普通牛和瘤牛兩種母系起源，以瘤牛血統為主；而Y染色體系統發育表明，文山牛的父系起源幾乎都是瘤牛。此外，Xia等[12]利用Y-SNPs結合Y-STRs的單倍型分型方法，對20頭文山牛的父系起源進行了調查，表明文山牛含有Y2和Y3兩種父系起源。但之前的研究用到的樣本量較少，對文山牛群體的代表性較低。因此，本研究利用Y-SNPs(UTY19和ZFY10)和Y-STRs(INRA189和BM861)標記，對55頭文山牛進行單倍型分析和父系起源研究，為加強云南文山牛種質資源保護和開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集與基因組DNA提取

在云南谷多農牧業有限公司那朵牧場采集55頭文山牛公牛的耳組織樣帶回實驗室，采用苯酚—氯仿方法[16]提取全基因組DNA，提取的基因組DNA

放在-20 ℃保存備用。用本實驗室保存的5頭荷斯坦牛公牛DNA做對照。

1.2 引物合成與PCR擴增

參照G?therstr?m等[5]和Ginja等[16]報道的2個家牛Y-SNP標記(UTY19和ZFY10)引物序列信息合成引物(表1)，參照Edwards等[10]發表的2對Y-STR標記(INRA189和BM861)引物序列信息合成引物(表2)。

PCR反應體系為12.5 μL：ddH2O 5.00 μL，2×Taq MasterMix 6.00 μL，上下游引物各0.25 μL(10 pmol/μL)，模板DNA 1.00 μL。擴增條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度見表1和表2)，72 ℃延伸30 s，36個循環，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用2%的瓊脂糖凝膠對PCR擴增產物進行電泳檢測，將檢測合格的PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序與分型。

表1 2對Y-SNP引物信息

表2 2對Y-STR引物信息

2 數據統計分析

結合已經發表的家牛序列(GenBank登錄號分別為AY936543和AF928827)，將UTY19和ZFY10測序結果用SeqMan v7.1軟件進行比對分析，找出相應的SNP位點。用GeneMarker V1.91軟件對熒光微衛星標記INRA189和INRA189的等位基因大小進行統計。由于不同酶對微衛星結果會產生1～2 bp的影響，所以本研究同時使用荷斯坦牛微衛星數據做校正，以保證結果的準確性。每個個體的單倍型都是利用Y-SNPs先確定家牛的單倍型組，繼而結合Y-STRs分型，二者共同確定出每頭牛的Y染色體單倍型(Y—SNP—INRA189-BM861)。用Arlequin V3.11軟件計算單倍型頻率和單倍型多樣度(H±SD)。

3 結果與分析

3.1 文山牛Y—SNPs多態性

將55頭文山牛2個Y—SNPs標記(UTY19和ZFY10)的PCR擴增產物的測序結果，與G?therstr?m等[5]和Ginja等[4]報道的家牛序列(GenBank登錄號：AY936543和AF928827)進行比對分析，結果表明：2個Y—SNPs標記在55頭文山牛中均不具有多態性。與標準序列相比，UTY19標記全部為C>A核苷酸顛換，而ZFY10標記全部為C>T核苷酸轉換。參考 G?therstr?m等[5]和Ginja等[4]對家牛Y染色體單倍型組的判定標準，依據2個標記的核苷酸變異確定單倍型組，結果顯示，55頭云南文山牛均為Y3單倍型組，對照組荷斯坦牛均為Y1單倍型組。

3.2 文山牛Y—STRs多態性

利用2個Y—STRs標記(INRA189和BM861)，對55頭文山牛Y染色體多態性進行檢測。在INRA189座位中共檢測到88 bp和90 bp兩個等位基因，所占個體數分別為49頭和6頭，均對應瘤牛Y3單倍型組；在BM861座位中僅檢測到一種等位基因(156 bp)，對應瘤牛Y3單倍型組。對照組荷斯坦牛在INRA189座位中為98 bp等位基因，在BM861座位中僅檢測到一種等位基因(158 bp)。

3.3 文山牛Y染色體單倍型頻率和單倍型多樣度

參照Edwards等[10]報道的Y—SNPs和Y—STRs標記結合的單倍型分型方法，對55頭文山牛的單倍型(Y—SNP—INRA189—BM861)進行分析，發現55頭文山牛均為Y3單倍型組，但有2種單倍型Y3—88—156和Y3—90—156，其中Y3—90—156單倍型頻率為0.09，Y3—88—156單倍型頻率為0.91，文山牛Y染色體單倍型多樣度為0.1684±0.0636；所有的荷斯坦公牛對照組都是Y1-98-158單倍型。

4 討 論

本研究旨在全面了解南方黃牛文山牛品種中Y染色體的遺傳多樣性，并提供父系起源和群體結構的分子證據。G?therstr?m等[5]首次從180個現代家牛樣本Y染色體基因中(DBY、UBE1Y、UTY19和ZFY10)找到了Y—SNP標記，成功區分出家牛的3種Y染色體單倍型組，即普通牛Y1、Y2和瘤牛Y3單倍型組。隨后不斷有報道驗證了Y—SNP標記在研究家牛父系起源的重要作用[7,10,12]。相比Y—SNP標記，Y—STR標記具有突變率高、多態性豐富等特點。Edwards等[8]利用不同牛種對4個牛Y—STR標記(INRA126、INRA124、INRA189和BM861)的特異性進行篩選，結果表明，INRA124、INRA189和BM861標記在家牛中均展現出普通牛和瘤牛的特異性。INRA189和BM861標記作為2個經典標記，在本研究中只有INRA189表現出多態性。

Li等[11]對中國16個地方黃牛品種Y—SNP和Y—STR進行多態性分析，發現中國黃牛有普通牛和瘤牛兩種父系起源，其中，北方黃牛以普通牛Y2為主，南方黃牛以瘤牛Y3為主。利用Y—SNPs和Y—STRs標記，李芳玉等[17]、侯佳雯等[18]分別對大別山牛和皖南牛的遺傳多樣性和父系起源進行研究，發現大別山牛和皖南牛這兩種南方黃牛均以瘤牛為主要的父系起源。然而，大多數關于文山牛品種遺傳多樣性的研究主要集中于線粒體DNA。不同于線粒體DNA和常染色體DNA的遺傳特征，Y染色體分子遺傳標記反映了動物父系遺傳特征，提供父系起源證據[19]。本研究采用Y—SNPs和Y—STRs相結合的單倍型分型方法(Y—SNP—INRA189—BM861)，對55頭文山公牛進行了單倍型分析，定義出文山牛2種Y染色體單倍型(Y3—88—156和Y3—90—156)，其中Y3—88—156單倍型占明顯優勢(0.91)，這說明文山牛具有與中國南方黃牛相似的血統來源，即以Y3—88—156瘤牛單倍型為主[12]。結果表明，文山牛只有瘤牛父系起源，這與Gou等[15]認為文山牛父系起源幾乎均為瘤牛研究結果相吻合。此外，也與最近Xia等[12]報道的對文山牛研究結果一致，20頭文山牛存在Y2—102—158和Y3—88—156兩種單倍型，其單倍型頻率分別為0.05和0.95。

單倍型多樣度是衡量一個群體變異程度的重要指標，單倍型多樣度高的群體說明其遺傳多樣性高，遺傳資源豐富。Edwards等[10]報道138個國外牛品種的單倍型多樣度平均值為0.422±0.269，Li等[11]研究發現中國16個中國黃牛品種的單倍型多樣度平均值為0.2258±0.0882，Xia等[12]研究發現34個中國黃牛品種的平均單倍型多樣度為0.607±0.016，均大于本研究調查的文山牛單倍型多樣度(0.1684±0.0636)，然而本研究結果和Xia等[12]研究發現文山牛單倍型多樣度(0.100±0.088)接近，這表明文山牛的分子遺傳多樣性較低，可能與采樣地區的公牛有效群體較小有關；另一方面，也說明文山牛父系種質資源比較純正，遺傳穩定，純合度高。