一株牛流行熱病毒的分離與鑒定

楚會萌　任亞初　程凱慧　蔣仁新　張云飛　解曉莉　張亮　楊宏軍

摘要：牛流行熱病毒（ BFFV）是引發(fā)世界范圍內牛流行熱最主要病原之一，給奶牛業(yè)的發(fā)展造成嚴重危害。本研究通過RT-PCR對疑似牛流行熱奶牛抗凝血樣品進行檢測，選取陽性樣品顱內接種3日齡乳鼠，7日后乳鼠死亡，鼠腦組織通過PCR擴增出BFFV目的條帶，乳鼠顱內重復接種3次，乳鼠發(fā)病死亡時間明顯提前。選取陽性腦組織接種BHK-21細胞，盲傳3代后出現(xiàn)明顯細胞病變，特異性引物擴增獲得目的條帶，測序結果與牛流行熱病毒序列一致，表明成功分離到一株牛流行熱病毒。

關鍵詞：牛流行熱病毒;分離與鑒定;BHK - 21細胞;細胞病變

Isolation and Identification of a Bovine Ephemeral Fever VirusChu Huimeng， Ren Yachu， Cheng Kaihui， Jiang Renxin，Zhang Yunfei， Xie Xiaoli， Zhang Liang， Yang Hongjun

Abstract Bovine ephemeral fever virus is one of the most pathogens leading to the bovine ephemeral fe-ver worldwide， which has caused serious harm to the development of dairy industry. In this study， the antico-agulant sample of suspected bovine ephemeral fever from Henan were tested by RT - PCR， then positive sam-ples was inoculated intracerebrally into sucking mice with 3 days of age. After 7 days， the suckling mice died.The target band of BFFV was identified by PCR from rat brain. After repeated intracranial inoculation for 3times， the death time of sucking mice were significantly advanced. Followed by inoculation of positive samplesinto BHK -21 monolayer cells， the CPE was obvious after three blind inoculation. The target band were ob-tained with the specific primers， and the sequencing was consistent with the bovine ephemeral fever sequence.The results showed that a bovine ephemeral fever virus was successfully isolated.

Keywords Bovine ephemeral fever virus; Isolation and identification; BHK -21 cell; Cytopathy

牛流行熱（ bovine ephemeral fever，BEF）又名牛暫時熱、牛三日熱，是由牛流行熱病毒（Bovineephemeral fever virus，BEFV）引起的一種牛急性熱性傳染病[1]。BEFV屬于彈狀病毒科（Rhabdoviri-dae）暫時熱病毒屬（Ephemerovims），為單股負鏈RNA病毒，有囊膜，目前只有一種血清型[2]。1867年，該病在東非地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，隨后在非洲、亞洲和澳大利亞等多個國家和地區(qū)流行[3]。1934年，我國江蘇省首次報道牛流行熱的爆發(fā)，1955年以后，大部分省份都有牛流行熱發(fā)病的報道[4]。牛流行熱的臨床典型癥狀為發(fā)熱，感染牛體溫可以升至40℃以上，其他臨床表現(xiàn)包括氣短、心率快、眼溢、結膜充血、跛行甚至臥地不起等[5]。期間乳產量明顯降低，部分懷孕母牛流產，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經濟損失。2014年農業(yè)部印發(fā)的《牛羊常見疫病防控技術指導意見》將牛流行熱列為重點防控疫病[6]。本實驗室從牛場采集疑似患牛流行熱的奶牛抗凝血[7]，進行病原分離鑒定，最終證明實驗室本次分離到的毒株為牛流行熱病毒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1. 1.1 病料 病牛臨床表現(xiàn)為持續(xù)幾天體溫40℃以上，眼鼻分泌物增多，食欲不振，病牛久臥不起，產奶量明顯下降。抽取病牛抗凝血，置于-4℃保存，以備檢測。

1.1.2 試驗細胞與動物 BHK-21細胞，由山東省農業(yè)科學院奶牛研究中心牛病研究室保存，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。3日齡乳鼠，購自山東大學實驗動物中心。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 病毒基因組RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;反轉錄試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司;DNA Marker購自寶生物工程（大連）有限公司;新生犢牛血清購自美國賽默飛公司;Ea.sy Taq PCRSuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;其他各種試劑、藥品均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank上公布的BE-FV參考序列設計引物BEFV-F和BEFV-R（表1），由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2 BEFV鑒定 將病牛發(fā)熱期抗凝血樣品分裝至2mL離心管中，取200μL樣品參照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書提取BEFV病毒基因組RNA，然后按反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板、BEFV -F和BEFV -R為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：12.5μL Mix，8.5μL ddH20，1μL BEFV -F，1μL BEFV -R，2μL模板cDNA。PCR擴增程序為：95℃ 10 min;94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1min，共30個循環(huán);72℃10 min，4℃保存。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。電泳結束后置于照膠儀中在紫外燈下觀察熒光并拍照記錄。將陽性擴增產物送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行測序，測序結果在NCBI進行BLAST同源性比較。

1.2.3 牛流行熱病毒接種乳鼠腦組織 將10只3日齡乳鼠隨機分組，其中8只為試驗組，2只為對照組。試驗組接種100μ1抗凝血至乳鼠顱內，對照組接種100μL無菌生理鹽水。接種位置為乳鼠左耳右眼連接線與右耳左眼連接線的交點處，也可選擇左耳左眼連接線中點或另一側中點，確保注射人乳鼠顱內。約7日后，對照組乳鼠發(fā)育較好并有毛發(fā)生出，試驗組乳鼠發(fā)育較差，并相繼死亡。

取出乳鼠腦組織，用1mL生理鹽水稀釋相應樣本，研磨后振蕩混勻，反復凍融3次。將反復凍融后樣本5000 r/min離心5min，取200 μL上清，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取BEFV病毒RNA，然后進行RT - PCR鑒定BEFV是否接種成功。

另選10只乳鼠重復試驗，試驗組接種100μL處理后陽性樣品至乳鼠顱內，對照組接種100μL無菌生理鹽水。正常喂養(yǎng)情況下，5日左右，試驗組相繼死亡，取鼠腦樣本進行PCR鑒定。鑒定為陽性的樣品進行第三次接種乳鼠腦組織，3日左右試驗組死亡。然后將死亡小鼠無菌解剖，采集乳鼠腦進行PCR -瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 牛流行熱病毒的分離鑒定

（1）樣本處理：將第三次接種乳鼠腦組織的BEFV樣本反復凍融3次，5000 r/min離心5 min取上清，在生物安全柜中用0.22μm濾膜過濾除菌。

（2）細胞接種牛流行熱病毒：選取匯合度約80%的單層BHK - 21細胞，棄去生長液，用PBS清洗細胞兩次，接種處理好的乳鼠腦組織BEFV病毒樣本上清液1 mL，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中吸附培養(yǎng)，期間每隔15min晃動細胞數(shù)次。吸附th后棄去上清液，PBS洗兩遍，再向培養(yǎng)皿中加入含2% FBS的DMEM維持培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每12 h觀察細胞病變（CPE）情況，連續(xù)觀察7d。出現(xiàn)病變的細胞反復凍融3次，收集細胞病毒液，5000 r/min離心5min后用病毒液再接種細胞;沒有出現(xiàn)CPE的細胞進行盲傳，盲傳到第3代仍沒有出現(xiàn)CPE，視為陰性。

（3）牛流行熱病毒的鑒定：取200μL病變細胞培養(yǎng)液，采用病毒基因組提取試劑盒提取RNA，然后利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，用BEFV - F/R為引物，進行PCR檢測。方法同

1.2.2，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結果與分析

2.1 PCR鑒定結果

提取24份發(fā)熱期病牛抗凝血樣品總RNA，隨后反轉錄為cDNA，經BEFV鑒定引物BEFV -F/R擴增到約420 bp的片段（圖1）。測序結果對比牛流行熱病毒全基因組核酸序列，可確定該病毒為BEFV。最終從24個檢測樣品中共檢測出5個BEFV陽性。

2.2 病毒分離鑒定結果

將初步鑒定BEFV陽性的抗凝血處理后，顱內接種3日齡乳鼠，接種1周后出現(xiàn)抽搐等神經癥狀，反復接種3次后乳鼠出現(xiàn)神經癥狀的時間明顯縮短到3—4d，死亡時間提前，說明BEFV經過乳鼠腦內接種后病毒滴度增高。

將接種乳鼠腦組織后的病毒接種BHK - 21細胞，傳至3代后出現(xiàn)明顯的細胞病變，傳至7代細胞CPE明顯（圖2）。提取接毒細胞上清液的總RNA，以BEFV - F/R為引物擴增到約420 bp的條帶，與預期相符（圖3）。測序結果對比牛流行熱病毒全基因組核酸序列，可確定該病毒為BEFV。

3 討論與結論

牛流行熱主要發(fā)病于奶牛、黃牛和水牛[8，9]。臨床上主要表現(xiàn)為高熱、眼鼻分泌物增多、食欲不振、肌肉僵硬、跛行、久臥不起，還可造成泌乳奶牛泌乳量下降，影響肉牛肉質，嚴重時可導致牛只死亡，給患病牛場造成重大經濟損失[10]。該病主要流行于大洋洲、非洲、亞洲及中東的40多個國家。在我國的20多個省市均有牛流行熱的報道[ll]。有報道表明，牛感染牛流行熱病毒后在血漿中可檢測到該病毒[12.13]。本實驗室通過RT-PCR方法，從發(fā)病牛外周血中擴增出牛流行熱病毒特異性DNA條帶，證實了發(fā)熱期病牛血中含有牛流行熱病毒。將初步鑒定BEFV陽性抗凝血處理后，顱內接種3日齡乳鼠，接種1周后出現(xiàn)神經癥狀，反復接種3次后乳鼠出現(xiàn)神經癥狀的時間明顯縮短到3—4d，死亡時間提前，說明接種乳鼠腦組織后病毒滴度增高。將病毒接種BHK-21細胞，傳至3代后出現(xiàn)明顯的細胞病變，利用BHK-21細胞分離病毒技術可獲得純種牛流行熱病毒。

近年來，牛流行熱在我國多地爆發(fā)流行，并且具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生于6-9月，流行迅猛，短期內可使大批牛只發(fā)病。該病呈周期性的地方流行或大流行，約3—5年大流行一次，大流行之后，常有一次小流行，且南方發(fā)病時間早于北方。每次疫情發(fā)病期也逐漸延長，臨床表現(xiàn)也比過去嚴重，對奶牛廠和肉牛場的經濟效益產生巨大的影響[14]。目前，市場上缺乏有效的防控措施和牛流行熱疫苗，該病毒株的分離鑒定為牛流熱新型診斷試劑和疫苗的研制奠定了基礎。

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