T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1在膀胱癌組織中的表達及其與膀胱癌復發的關系

蘇宏偉 劉軍超 李 婷 曹 娟 李 晨 劉 鑫 李向東

(河北北方學院附屬第一醫院1 泌尿外科，2 病理科，張家口市 075000,電子郵箱：suhwwww@sina.com；3 河北省張家口市第二醫院藥械科，張家口市 075000)

膀胱癌是泌尿系統中常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居泌尿系統腫瘤前列[1]。資料顯示，2016年全球膀胱癌的發病人數約43萬，死亡人數約16.5萬，其發病率和死亡率均呈上升趨勢，嚴重威脅人類的生命安全[2]。盡管手術聯合放化療可以提高膀胱癌患者的總體生存率，但仍有部分患者出現復發和轉移，導致其5年生存率仍較低[3]。膀胱癌的侵襲和轉移是影響膀胱癌患者治療和預后的重要因素，因此，探討膀胱癌侵襲和轉移的分子機制具有重要意義。大量研究顯示[4-8]，T淋巴瘤侵襲轉移誘導因子1(T-lymphoma invasion and metastasis-inducing factor 1，Tiam1)在多種腫瘤中呈高表達，與腫瘤細胞的侵襲、轉移、惡性程度及預后密切相關。然而，目前關于Tiam1在膀胱癌組織中表達的研究較少。本研究探討Tiam1在膀胱癌組織中的表達及其與膀胱癌患者預后的關系，為膀胱癌的早期診斷、臨床治療及預后評估提供參考。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選擇2009年1月至2013年4月在我院泌尿外科住院手術治療的233例膀胱尿路上皮癌患者，收集其膀胱癌組織，其中男125例、女108例；年齡(57.4±6.7)歲；術后病理結果提示低級別尿路上皮癌127例，高級別尿路上皮癌106例；行膀胱部分切除術18例，膀胱根治性切除77例。納入標準：(1)均經病理確診為膀胱尿路上皮癌；(2)均具有完整的臨床資料、病理資料及隨訪資料；(3)術前均未接受放療、化療(包括膀胱灌注)等治療。排除標準：(1)合并其他器官惡性腫瘤；(2)曾行化療、放療，包括新輔助化療；(3)合并膀胱結石。膀胱癌組織標本分為兩部分，一部分行常規蠟塊包埋，一部分于液氮中凍存。另取同期50例行恥骨上前列腺切除術的男性患者的正常膀胱組織為對照組，年齡(61.5±4.7)歲，正常膀胱組織存于液氮中冷凍備用。所有患者均常規膀胱鏡隨訪5～7年，2年內每3個月復查1次，2年后每半年復查1次，5年后每年復查1次，記錄復發情況。本研究獲河北北方學院附屬第一醫院倫理委員會審查通過，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人Tiam1單克隆抗體(批號：sc-377355)、β-肌動蛋白抗體(批號：sc-9996)、生物素標記的二抗(鼠抗兔多克隆抗體，批號：sc-2004)均購于美國Santa Cruz公司。免疫組化試劑盒(批號：PV-9000)購于北京中杉金橋公司。引物設計由上海生工生物工程有限公司提供。PCR試劑盒(批號：4472908)、總RNA提取試劑盒(批號：15596-018)、逆轉錄試劑盒(批號：k1622)購于美國Invitrogen公司。Bio-Rad iMark型酶標儀、Bio-Rad ChemiDoc MP型凝膠成像分析儀均購于美國Bio-Rad公司，CKX53型倒置顯微鏡購于日本Olympus公司。

1.3 免疫組化檢測Tima1蛋白陽性率 將膀胱癌及正常膀胱組織標本用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后，用切片機切成厚度為4 μm的切片，經二甲苯和酒精脫蠟水化后，加入pH=7.4、濃度為0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液高壓修復，并以3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶。以非免疫血清封閉后，加入Tima1抗體(1 ∶150稀釋)孵育，4℃過夜，再加入生物素標記二抗，孵育20 min。加入鏈霉菌素抗生素(辣根酶標記)溶液反應10 min，經二氨基聯苯胺顯色、蘇木精復染和常規脫水封片后，磷酸緩沖鹽溶液代替一抗作為陰性對照。顯微鏡下隨機選取5個視野。觀察每個組織的細胞著色情況，每張切片均由兩名高年資病理科醫生進行觀察。Tima1蛋白主要定位于細胞膜和細胞質中，棕褐色顆粒為強陽性，棕黃色為陽性，淡棕色顆粒為弱陽性，無顯色為陰性。細胞出現強陽性、陽性、弱陽性染色均判斷為表達陽性，表達陽性率=陽性切片數/總例數×100%。

1.4 實時定量PCR檢測Tiam1 mRNA表達 采用總RNA提取試劑盒提取兩組標本的總RNA，用逆轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA，取10 μL cDNA加入PCR反應試劑盒中，以25 μL總反應體系進行實時定量PCR擴增，按照35個循環(95℃ 30 s、56℃ 15 s、72℃ 30 s)的反應條件進行擴增。實驗重復3次。取5 μL PCR擴增產物，上濃度為1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，以β-肌動蛋白作內參對照，2-△△CT法計算Tiam1 mRNA的相對表達情況。β-肌動蛋白上游引物序列5′-CTGTGCCCATCTACGAGGGGTATG-3′，下游引物序列5′-CCTTAATGTCACGCACGATTTCCC-3′；Tiam1上游引物序列5′-GCCAAGAACAT-TTAACAAGCAACG-3′；下游引物序列5′-TCTGAGCATACAAGTCACCCAAGG-3′。

1.5 蛋白免疫印跡檢測Tiam1 蛋白表達 參照總蛋白提取試劑盒說明書提取兩組標本總蛋白，加入等量的上樣緩沖液，置于沸水浴中變性3～5 min，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以美國伯樂Mini-Protean Ⅱ蛋白電泳槽將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上后，浸入1×TBST(含5%脫脂奶粉)中平衡2 h。加入一抗Tiam1和β-肌動蛋白抗體(1 ∶800稀釋，4℃，孵育過夜)和辣根過氧化酶標記的二抗(1 ∶2 000稀釋，37 ℃，孵育2 h)，以化學發光劑ECL顯色，凝膠成像系統掃描檢測。結果用Tiam1灰度值比β-肌動蛋白灰度值的相對值表示。

1.6 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，計數資料采用例數或百分數表示，比較采用χ2檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，影響因素分析采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1蛋白陽性表達率比較 Tiam1在正常膀胱黏膜上皮細胞及膀胱癌細胞中均表達，主要分布在細胞膜和細胞質中，染色呈黃色至棕褐色不等(圖1)。正常膀胱黏膜上皮細胞Tiam1表達陽性率為14.00%(7/50)，低于膀胱癌細胞的58.79%(137/233)(χ2=11.037，P<0.001)。

正常膀胱 低級別非肌層浸潤性膀胱癌 高級別非肌層浸潤性膀胱癌 高級別肌層浸潤性膀胱癌

圖1 Tiam1在膀胱癌中的表達(×400)

2.2 膀胱癌Tiam1蛋白陽性表達組與Tiam1蛋白陰性表達組的臨床病理特征 膀胱癌Tiam1陽性表達組和Tiam1陰性表達組的病理分級、病理分期、淋巴結轉移情況及復發率比較，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 Tiam1蛋白陽性表達組和Tiam1蛋白陰性表達組膀胱癌患者的臨床病理特征

注：*行根治性手術77例患者不予統計復發情況。

2.3 Cox多因素回歸分析 以是否復發(否=0，是=1)為因變量，性別(男=0，女性=1)、年齡(≤50歲=0，>50歲=1)、病理分級(低級別=0，高級別=1)、病理分期(Ta～T1=0，T2～T3=1)、腫瘤數目(單發=0，多發=1)、腫瘤直徑(≤2 cm=0，>2 cm=1)、淋巴結轉移情況(否=0，是=1)、Tiam1蛋白表達情況(陰性=0，陽性=1)為協變量進行Cox回歸分析，結果顯示，病理高分級、病理分期為T2～T3、淋巴結轉移陽性及Tiam1蛋白表達陽性是膀胱癌患者復發的危險因素(均P<0.05)，見表2。

表2 膀胱癌復發的多因素分析

2.4 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1 mRNA相對表達量比較 正常膀胱細胞和膀胱癌細胞中Tiam1 mRNA的相對表達量分別為(1.603±0.571)、(3.324±0.679)，兩者比較差異有統計學意義(t=8.602，P<0.001)。低級別非肌層浸潤性膀胱癌、高級別非肌層浸潤性膀胱癌、高級別肌層浸潤性膀胱癌Tiam1 mRNA的相對表達量分別為(3.007±0.611)、(3.933±1.003)、(5.377±1.085)，三者比較差異有統計學意義(F=13.033，P<0.001)，見圖2。

圖2 正常膀胱組織與膀胱癌組織中的Tiam1 mRNA表達

注：M為Marker，N為正常膀胱組織，1為低級別非肌層浸潤性膀胱癌，2為高級別非肌層浸潤性膀胱癌，3為高級別肌層浸潤性膀胱癌。

2.5 膀胱癌與正常膀胱組織Tiam1蛋白的相對表達量比較 正常膀胱組織與膀胱癌組織中Tiam1 蛋白的相對表達量分別為(1.654±0.610)、(3.473±0.751)，兩者比較差異有統計學意義(t=10.011，P<0.05)。低級別尿路上皮癌、高級別非肌層浸潤性膀胱癌及高級別肌層浸潤性膀胱癌中Tiam1 蛋白的相對表達量分別為(2.985±0.455)、(3.002±1.033)、(5.150±1.441)，三者比較差異有統計學意義(F=15.370，P<0.001)，見圖3。

圖3 Tiam1蛋白在正常膀胱組織及膀胱尿路上皮癌中的表達

注：N為正常膀胱，1為低級別尿路上皮癌，2為高級別非肌層浸潤性尿路上皮癌，3為高級別肌層浸潤性尿路上皮癌。

3 討 論

90%以上的原發性膀胱癌經手術治療后均取得較好效果，但膀胱癌術后5年復發率為60%左右，且30%左右的患者會進展為浸潤性膀胱癌，而目前對于浸潤性和復發性膀胱癌的治療效果有限，預后較差[9-10]。腫瘤轉移與患者預后密切相關，而目前膀胱癌侵襲轉移的潛在分子機制尚未完全闡明，因此，本研究探討Tiam1在膀胱癌組織中的表達情況，擬為膀胱癌的治療提供新靶點。

Tiam1屬于鳥苷酸交換因子家族成員之一，是一種具有高度親水性的胞液蛋白質，其功能區域從N端至C端依次為Myr位點、PEST序列、PHn-CC-Ex、RBD、DHR、DH以及PHc結構域[11]。Tiam1可通過與脂類或蛋白質分子結合進行亞細胞定位及活性調節，可催化Rho類蛋白的二磷酸鳥苷-三磷酸鳥苷交換反應，參與調節Rho類蛋白活性，傳導不同細胞內信號激活Rho三磷酸鳥苷酶，從而在多種生物分化過程中起作用[12]。Tiam1可特異性激活Ras相關的C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)，通過Tiam1-Rac1信號通路調控腫瘤細胞的侵襲和轉移[13-14]。研究表明，Tiam1通過激活骨橋蛋白-CD44-Tiam1-Rac1通路抑制腫瘤抑制基因Rho二磷酸鳥苷離解抑制因子2，從而促進膀胱癌細胞的轉移及擴散[15]。

本研究采用免疫組化方法檢測Tiam1蛋白在膀胱癌組織中的表達情況，結果顯示，正常膀胱及膀胱癌組織中均有Tiam1蛋白的陽性表達，但膀胱癌組織中的Tiam1蛋白表達陽性率高于正常膀胱組織(P<0.05)，且低分期、低分級、未發生淋巴結轉移及未復發的膀胱癌患者的膀胱癌組織中Tiam1蛋白表達陽性率低于高分期、高級別、淋巴結轉移陽性及復發的膀胱癌患者(均P<0.05)，蛋白免疫印跡及實時定量PCR結果也證實，Tiam1蛋白在膀胱癌中的表達高于正常膀胱組織，說明Tiam1作為促癌基因，在膀胱癌的發生、發展中發揮重要作用。本研究多因素Cox回歸分析結果顯示，腫瘤病理高分級、高分期、淋巴結轉移陽性及Tiam1蛋白表達陽性是膀胱癌患者復發的危險因素(均P<0.05)，提示Tiam1蛋白可以作為膀胱癌復發的預測因子，應對Tiam1陽性表達的膀胱癌患者進行密切的觀察隨訪，以早期診斷及治療。

綜上所述，Tiam1在膀胱癌中表達升高，且Tiam1蛋白表達陽性與膀胱癌復發密切相關，是膀胱癌進展、復發的重要細胞因子，但其促進膀胱癌發生、發展的具體機制尚有待進一步研究。