蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留測定的QuEChERS應用與優化

徐緯，劉天潔，黃琴

(1.貴州醫科大學 公共衛生學院 環境污染與疾病監控教育部重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.四川省自貢市疾病預防與控制中心， 四川 自貢 643000)

蔬菜農藥殘留會對人體健康造成嚴重影響[1]。五氯硝基苯和百菌清屬保護性殺菌劑，前者對蔬菜苗期病害防治效果較好，但其毒性危害、環境污染、農藥殘留等問題日益突出，已在多個國家被禁用或限制使用[2]；后者對多種作物真菌病害具有預防作用，黏著性較好、但殘效期長，對生態環境和食品安全具有潛在威脅[3]。我國對蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留均規定了檢測方法和限量標準[4-5]，但其檢測方法的樣品前處理操作較為復雜。樣品前處理是影響檢測速度和準確度的關鍵環節，目前農藥殘留檢測前處理技術主要有固相萃取、固相微萃取、分散固相萃取(QuEChERS)、凝膠凈化、超臨界液體萃取及分子印跡技術等[6-7]，其中QuEChERS是近年發展起來的一種快速樣品前處理技術，其回收率高、分析速度快、溶劑使用量少、操作簡便，現已逐步應用于農藥殘留檢測中[8-9]。本文在以前研究基礎上[10-16]，優化建立了氣相色譜-質譜聯用儀(GC-MS)測定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量的QuEChERS 樣品前處理方法，其應用將有利于降低環境污染、保障分析人員健康和促進食品中農藥殘留監測水平提升。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

5957C型氣相色譜-質譜聯用儀(Agilent公司)，DN-24W型氮氣吹干儀(上海比朗儀器制造有限公司)，AL204-1C型分析天平(Mettler Toledo公司)，XH-1型渦旋混勻器(江蘇康健醫療用品有限公司)，543OR型離心機(Eppendorf公司)，弗羅里矽固相萃取柱(Florisil-SPE柱，北京振翔科技有限公司)，QuEChERS柱(CNW公司)。五氯硝基苯標準品(99.0%，C16730000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，百菌清標準品(98.0%，C11510000，Dr.Ehrenstorfer GmbH)，正己烷、乙腈、丙酮 (色譜純)及其他試劑均為分析純?？瞻讟悠窞楝F行農業行業標準DB-1毛細管柱氣相色譜電子捕獲檢測法[5]未檢出五氯硝基苯與百菌清殘留的蔬菜，檢測樣品為市場購買蔬菜。

1.2 方法

1.2.1儀器條件 色譜條件：DB-35 MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 μm)，程序升溫(40 ℃保持1 min, 30 ℃/min升溫至130 ℃，5 ℃/min升溫至250 ℃保持5 min)，進樣口溫度260 ℃，載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，柱流速1.2 mL/min，不分流進樣。質譜條件：EI離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲10 min，選擇離子掃描(SIM)，五氯硝基苯定量離子295、定性離子237和249，百菌清定量離子266、定性離子264和268。

1.2.2標準溶液的配制 精密稱取五氯硝基苯和百菌清標準品各0.001 g于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解并定容，即得0.100 g/L五氯硝基苯和百菌清混合標準溶液。

1.2.3樣品的前處理方法 本研究前處理方法：樣品勻漿處理后精密稱取15 g，加入氯化鈉5 g和正己烷20 mL，渦旋混勻5 min，20～30 ℃超聲提取30 min，加入無水硫酸鈉8 g，充分振蕩，4 000 r/min離心5 min，取上清液10.0 mL經QuEChERS柱凈化后，氮氣吹至凈干，用正己烷定容至1.0 mL，1.0 uL進樣測定?，F行農業行業標準NY/T 761-2008前處理方法[5]：樣品勻漿處理后精密稱取25.0 g，加入乙腈50.0 mL，高速勻漿2 min后用濾紙過濾，收集濾液40～50 mL至裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，劇烈震蕩1 min，靜置30 min，吸取乙腈溶液10.0 mL于150 mL燒杯中，80 ℃水浴氮氣至近干，加入正己烷2.0 mL，倒入預淋洗處理后的Florisil-SPE柱，用5 mL丙酮+正己烷(10+90)沖洗燒杯后淋洗Florisil-SPE柱，重復1次，收集洗脫液，于50 ℃水浴氮吹至<5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，1.0 uL進樣測定。

2 結果

2.1 QuEChERS條件優化試驗

2.1.1提取溶劑的選擇 取空白樣品，分別加入五氯硝基苯和百菌清各1、3、5 μg，按1.2.3前處理方法操作，并分別以乙腈和正己烷為提取溶劑，在1.2.1條件下測定，比較兩者的提取效率，結果顯示，正己烷的提取效率優于乙腈。見圖1。

圖1 不同溶劑對回收率的影響Fig.1 Effect of different solvents on recovery rate

2.1.2超聲溫度對提取效率的影響 取空白樣品，加入五氯硝基苯和百菌清各3 μg，按1.2.3項下的前處理方法操作，并改變超聲溫度，在1.2.1條件下測定。結果顯示，五氯硝基苯和百菌清的提取效率在20～30 ℃時最高。見圖2。

圖2 超聲溫度對提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasound temperature on extraction efficiency

2.2 專屬性試驗

取15 g空白樣品，加入50 μL混合標準溶液，按1.2.3項下的前處理方法操作，按照1.2.1條件采用全掃描模式測定，經NIST譜庫檢索結果顯示，色譜峰1為五氯硝基苯、保留時間為14.128 min，色譜峰2為百菌清、保留時間為14.966 min，兩峰完全分離。見圖3。

注：1為五氯硝基苯，2為百菌清圖3 五氯硝基苯和百菌清總離子流色譜圖Fig.3 Total ion chromatography of pentachloronitrobenzene and chlorothalonil

2.3 線性關系試驗

2.4 方法檢出限試驗

取空白樣品，分別按1.2.3項下的前處理方法和NY/T 761-2008前處理方法操作，在1.2.1條件下連續測定11次，以3倍信噪比計算五氯硝基苯和百菌清的方法檢測限。結果表明，本文選用的前處理方法與NY/T 761-2008前處理方法的五氯硝基苯檢出限分別為0.006 7 μg/g和0.007 2 μg/g、百菌清檢出限分別為0.003 2 μg/g和0.004 1 μg/g，本文前處理方法相對于NY/T 761-2008前處理方法有較高的靈敏度。

2.5 回收率和精密度比對試驗

取同批次蔬菜搗碎勻漿后，精密稱取48份樣品各15 g，均分為兩組，分別按1.2.3項下的前處理方法和NY/T 761-2008前處理方法處理樣品， 按照1.2.1條件進行加標回收率和精密度試驗，結果顯示，本文采用的前處理方法獲得的五氯硝基苯和百菌清回收率分別為81.2%～84.1%和78.3%～79.0%，RSD分別為4.9%～6.4%和4.5%～5.4%，滿足《實驗室質量控制規范食品理化檢測》要求[17]，相對于NY/T 761-2008前處理方法具有較好的準確度和精密度。見表1。

2.6 樣品測定

分別取3個批次的蔬菜樣品，按1.2.3方法處理、并在1.2.1儀器條件下測定，五氯硝基苯和百菌清均未檢出，符合我國國家標準《GB2763 -2016食品中農藥最大殘留限量》規定限量要求[4]。

表1 兩種前處理方法的回收率和精密度比較(n=6)Tab.1 The comparison of recovery and precision of two pretreatment methods

3 討論

蔬菜中色素較多，在農藥殘留測定中將增加基質干擾，使靈敏度降低，且對色譜柱污染較為嚴重，故在樣品前處理中有效去除色素較為關鍵。本文比較農藥殘留檢測中常用的乙腈和正己烷兩種提取溶劑，因乙腈極性較大，并能與水互溶，導致提取液中水溶性色素等雜質增加，故乙腈提取液相對于正己烷提取液顏色較深；另乙腈沸點高于正己烷，故其提取液濃縮時間較長，將增大目標物損失的可能性。從圖1可以看出，正己烷對目標物的提取率較高，并能有效分離去除水溶性雜質，縮短樣品前處理時間。通過比較QuEChERS和Florisil-SPE兩種樣品凈化方式，QuEChERS凈化柱對目標物吸附損失較小，且除雜效果較好，操作較簡便，溶劑用量較少，能有效提高檢測的靈敏度、精密度和準確度，故其在農藥殘留檢測中將更容易被推廣使用。樣品前處理過程中，超聲溫度對農藥殘留測定結果影響較大，溫度過低則目標物提取效率較低，溫度過高則目標物揮發損失較大。圖2表明，五氯硝基苯和百菌清的超聲提取溫度在20～30 ℃時較為適宜。

由于近年來農藥限制使用及其殘留量監測力度加強，且采樣時期恰逢雨季，較難在市場上采集到五氯硝基苯和百菌清殘留的樣品，故樣品測定時均未檢出五氯硝基苯和百菌清，但從本文專屬性、檢出限、精密度、回收率等方法學試驗和方法比對試驗可以看出，本文方法同時測定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留具有較好的適用性和優越性。本文在前研究基礎上，經方法學試驗和方法比對試驗，優化建立了GC-MS測定蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量的QuEChERS 樣品前處理新方法，該方法具有提取效率高、除雜效果好、操作簡便、溶劑使用量少等特點，縮短了樣品前處理時間，提高了蔬菜中五氯硝基苯和百菌清檢測的靈敏度、精密度和準確度，適用于蔬菜中五氯硝基苯和百菌清殘留量同時測定，能為其他農藥殘留檢測提供方法參考，促進食品農藥殘留監測標準提升，并對QuEChERS前處理方法推廣應用具有積極作用。