促紅細胞生成素通過AMPK-KLF2信號通路調節腦缺血后血管新生的分子機制*

劉敏， 王英， 王敬東， 張鳳香， 李紅燕

(青島大學醫學院附屬第二醫院 重癥醫學科， 山東 青島 266042)

促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種糖蛋白激素，是哺乳動物調節紅細胞生成必不可少的體液性生長因子[1]。在臨床上，EPO多用于治療腎功能不全合并的貧血、惡性腫瘤伴發的貧血及風濕病貧血等[2-3]。有研究表明他汀類藥物能通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)上調轉錄因子KLF2的表達、增加NO的合成、并作用于血管內皮細胞，從而促進血管新生[4-7]。血管新生是影響動脈粥樣硬化及多種缺氧、缺血性心血管疾病的病程發展和轉歸的重要因素[8]。Dorsomorphin (Compound C) 2HCl是一種有效的、可逆的、選擇性AMPK抑制劑。本研究旨在通過構建大腦中動脈栓塞動物模型，給予Compound C干預，觀察動物新生血管數目及AMPK-KLF2信號通路mRNA和蛋白的表達情況，探究EPO通過AMPK-KLF2信號通路調節腦缺血后血管新生的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級24周雄性SD大鼠92只，體質量250～280 g，由青島大學醫學院動物實驗中心提供(合同號2018-0216)。

1.2 動物分組與造模

1.2.1大腦中動脈栓塞(MCAo)模型的建立 參考畢方方等[8]方法進模：取250～280 g大鼠76只，4%水合氯醛麻醉固定，于頸正中縱切口，暴露右側頸內動脈、頸總動脈和頸外動脈，準備兩個動脈夾、一個動脈夾夾住頸總動脈的向心端，一個動脈夾夾住頸內動脈的遠心端；用線結扎頸外動脈遠心端，在頸外動脈的向心端的管壁上剪“V”形切口，通過自制4-0線栓經過切口繞過頸動脈竇向頸內動脈放置，結扎勁外動脈“V”切口下方；打開頸內動脈動脈夾，再打開頸總動脈動脈夾。另16只大鼠(假手術組)只做手術、分離血管，但不夾閉或結扎任何血管、亦不放置線栓及不在外動脈上做切口。

1.2.2分組 24周清潔級雄性SD大鼠92只，16只大鼠用于假手術組，76只大鼠造模成功的64只，隨機均分成腦缺血組、Compound C組、EPO組及EPO+Compound C組，每組16只。腦缺血組大鼠造模后每天腹腔注射生理鹽水，Compound C組在大鼠造模24 h后每天腹腔注射Compound C溶液1 mL，EPO組在大鼠造模24 h后每天注射EPO 1 mL(4 000 UI/kg)。EPO+Compound C組大鼠造模24 h后每天注射 Compound C 和EPO溶液各1 mL，藥物總劑量同Compound C組和EPO組，均注射7 d;假手術組僅4%水合氯醛麻醉后固定，于頸正中縱切口，暴露右側頸內動脈、頸總動脈和頸外動脈，不夾閉頸內動脈和用線結扎頸外動脈遠心端及在頸外動脈的向心端的管壁上剪“V”形切口。

1.3 新生血管數目

顯微鏡下觀察，完成造模和干預7 d時取大鼠大腦缺血皮質制片，鏡下觀察頂葉缺血周圍區新生血管并計數全部新生血管數目。

1.4 RT-PCR檢測

完成造模和藥物干預7 d時，取200 mg大鼠大腦缺血皮質提取總RNA，將組織放入1.5 mL EP管中，加入1 mL Trizol剪碎組織，震蕩30 s，加0.2 mL氯仿，劇烈搖動30 s，室溫3 min；12 000 r/min，4 ℃離心，15 min；計算濃度與純度，-70 ℃保存。采用RT-PCR檢測Krueppel樣因子2(krueppel-like factor 2，KLF2)、內皮一氧化氮合酶(eNOS)、血栓調節蛋白(thrombomodulin，TM)及血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)mRNA水平；PCR反應體系為10×擴增緩沖液(PCR Buffer×10 μL)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix×200 umol/L)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶×2.5 μL)、寡聚核苷酸引物(Primer1×40 pmoL，Primer2×40 pmoL)、靶序列模板DNA(1 μg)。反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min(40個循環)95 ℃ 30 s，61 ℃ 15 s。取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，以β-actin作為參照，計算KLF2、eNOS、TM及VEGFmRNA水平。

表1 引物的核苷酸序列Tab.1 Sequence of the primers

1.5 免疫印跡檢測腦缺血區域的AMPK及KLF2蛋白表達

取0.1 g腦大鼠大腦缺血皮質，加500 μL蛋白裂解液，在冰浴下震蕩0.5 h，將液體移至1.5 mL離心管中，在4 ℃冷凍離心機中12 000 r/min離心20 min，取上清，利用BCA蛋白法對蛋白濃度進行測定。加入適量上樣緩沖液，100 ℃水浴加熱5 min，使蛋白變性，8 000 r/min離心5 min后上樣。通過SDS-PAGE凝膠電泳進行分析，上樣量為20～40 μL/孔，轉膜與雜交。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 模型成功率評價

76只建模，造模失敗12只，1只不明原因死亡、5只未觀察到神經功能缺損、1只死于麻醉過量、3只出現蛛網膜下腔出血、1只在觀察中死亡，(解剖可見左側腦組織嚴重腫脹)以Fabian的神經功能5級標準評分法為標準(≥1分)，造模成功64只，模型成功率達到85.5%。造模成功大鼠手術后2 h左右清醒、精神萎靡、反應遲鈍、活動及進食減少甚至拒食；大鼠右前肢無力，不能抓桿且爬桿困難；大鼠行走時，身體向右側旋轉或偏斜，身體向右側旋轉或偏斜，甚至向右側跌倒不能行走，多數動物出現Homers征。65只大鼠隨機分為4組，棄掉1只。假手術組大鼠未出現明顯神經功能缺損癥狀與體征，手術后動物進食及活動恢復較好。

2.2 顯微鏡下觀察新生血管數目

EPO組大腦皮質新生血管數量較腦缺血組增多，差異有統計學意義(27.46±2.58 vs 16.21±1.22，P<0.05)， Compound C組和EPO+Compound C組大鼠大腦皮質新生血管數目少于腦缺血組(12.15±1.27 vs 14.32±2.11，P<0.05)，EPO+Compound C組大鼠大腦皮質新生血管數目多于Compound C組，少于腦缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)， 鏡下新生血管形態見圖1。

注：A為假手術組，示正常腦組織形態；B為腦缺血損傷后出現新生血管，箭頭所指示新生血管處圖1 頂葉缺血周圍區新生血管形態Fig.1 Morphology of neovascularization around parietal lobe ischemia

2.3 KLF2、eNOS、TM及VEGF mRNA表達

RT-PCR實驗對各組大鼠大腦缺血皮質KLF2、eNOS、TM和VEGF的mRNA的表達量進行測定發現， EPO組各mRNA的表達量較腦缺血組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，Compound C組KLF2、eNOS、TM和VEGFmRNA的表達量低于腦缺血組(P<0.05)，EPO+Compound C組KLF2、eNOS、TM和VEGFmRNA的表達量高于Compound C組(P<0.05)，低于腦缺血組，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 mRNA表達量的測定結果(n=16)Tab.2 Detection results of mRNA expression levels

(1)與腦缺血組比較，P<0.05；(2)與Compound C組比較，P<0.05

2.4 AMPK及KLF2蛋白表達

通過檢測KLF2及AMPK蛋白表達水平發現，正常組與假手術組大鼠有少量AMPK及KLF2蛋白表達，差異無統計學意義(P>0.05)。Compound C組AMPK及KLF2蛋白表達水平低于腦缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)，EPO組AMPK蛋白的表達水平與腦缺血組比較有所增加，EPO+Compound C組AMPK及KLF2蛋白的表達水平高于Compound C組，低于腦缺血組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 KLF2及AMPK蛋白的表達水平(n=16)Tab.3 Expression levels of KLF2 and AMPK protein

(1)與腦缺血組比較，P<0.05；(2)與Compound C組比較，P<0.05

圖2 大腦皮質AMPK和KLF2蛋白 在不同組別的表達Fig.2 Expression levels of KLF2 and AMPK protein in different groups

3 討論

腦缺血后，血管新生是腦微循環修復重建的重要病理過程[9]，而神經血管單元促成細胞分泌、釋放促血管新生因子，例如EPO、VEGF等，從而促進缺血區血管生成[10]。有研究指出，EPO的來源有血源性與腦源性兩種，是一種直接促血管新生物質，可促進套式血管生長和芽生，促進VEGF的表達，，同時促進腦血管新生和骨髓造血[11]。另EPO為中樞神經系統內源性的細胞因子，可通過神經元與膠質細胞的旁分泌作用，作用至神經元EPO-R，并發揮神經保護、神經營養及調節胚胎發育的作用[12]。據報道，EPO可引起AMPK和eNOS的磷酸化作用[13]，在此過程中，同時促進了KLF2蛋白質的表達水平[14]。復合物C或Ad-AMPK-DN抑制AMPK后限制了KLF2的表達上調，這是一種重組腺病毒，它編碼了AMPK的顯性負突變體[15-16]。本研究以Compound C為抑制劑成功建立了AMPK缺陷腦缺血大鼠模型。有研究表明，KLF2的敲除降低了eNOS和VEGF，并限制了紅細胞生成素的遷移和內皮細胞集落形成新生血管的能力[17]。故AMPK通路中KLF2表達的上調在EPO誘導血管生成中起著至關重要的作用[18-19]。本研究表明，EPO治療+Compound C干預組各mRNA的表達量高于Compound C干預組，由此結果可以推測出，加入AMPK抑制劑后，KLF2的表達量下降，并且eNOS、TM、VEGF等mRNA的表達量均呈現下降的趨勢。據報道，EPO可以激活AMPK蛋白激酶，提高ECs分化，最終促進血管新生。另有研究者認為，EPO的血管生成效應是通過VEGF/KDR完成的[20,21]。相反，也有研究指出，由EPO控制的ECFCs的血管生成能力依賴于AKT而不是VEGF[22]。但在ECFCs中EPO的血管生成效應以及相關的分子機制，特別是轉錄水平的機制，仍然不清楚。而本實驗研究發現，EPO治療組新生血管數量較腦缺血組增多，EPO治療+Compound C干預組新生血管數目多于Compound C干預組。同時， AMPK及 KLF2蛋白表達量測定結果表明，EPO治療+Compound C干預組AMPK及 KLF2蛋白的表達量高于Compound C干預組，故推測EPO可通過促進AMPK及 KLF2蛋白的表達量，激活AMPK，上調KLF2的表達，促進內皮一氧化氮合酶(eNOS)表達，進而增加NO產生，促使內皮克隆形成細胞向內皮細胞分化，進而提高血管新生。

綜上所述，EPO可通過上調KLF2、eNOS、TM、VEGFmRNA的表達量，促進AMPK蛋白的表達進而調節腦缺血后血管新生。