丹黃散對糖尿病大鼠潰瘍創面愈合的影響機制*

邸鐵濤， 張春玲**， 陳露， 侯丹， 劉洹穎， 龍麗， 黃薔

(1.貴州中醫藥大學第二附屬醫院， 貴州 貴陽 550001; 2.貴州中醫藥大學， 貴州 貴陽 550025)

糖尿病潰瘍(diabetic ulcers，DU)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)最常見的并發癥之一，據統計30% 的糖尿病患者會發生皮膚潰瘍，且潰瘍存在難以愈合等問題。目前促進糖尿病潰瘍愈合成為研究熱點，調控生長因子的輔助療法在糖尿病潰瘍治療中具有顯著優勢[1]。研究發現，潰瘍的愈合與創面的表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、血管內皮生長因子(VEGF)等密切相關，這些因子的表達可促進創面的愈合[2]。中藥丹黃散由大黃、丹參、當歸、沉香、松香、沒藥共六味傳統中藥組成，具有清熱解毒、祛腐生肌等功效[3-5]。研究顯示，丹黃散可明顯促進糖尿病患者潰瘍創面的愈合，具體有很好的臨床療效[6]，但其促愈機制尚未見報道。本實驗通過建立SD大鼠糖尿病潰瘍模型，使用中藥丹黃散外敷糖尿病大鼠潰瘍創面，觀察創面愈合過程中大鼠血清及局部創面組織中EGF、bFGF、VEGF的表達水平，探討丹黃散促進糖尿病潰瘍愈合的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物、試劑與儀器 SPF級SD大鼠，雄性，200 g左右，購自重慶醫科大學動物研究所。酶聯免疫試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司，VFGF、β-actin購自proteintech公司，bFGF、EGF購自美國abcam公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/山羊抗小鼠IgG購自中山金橋公司。

1.1.2藥物制備 中藥丹黃散由貴州中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科制備，大黃、丹參、當歸、沉香、松香、沒藥六味中藥按照1∶1比例混合、粉碎、過六號篩后取細粉。對照西藥選用重組人EGF凝膠(購自桂林華諾威基因藥業有限責任公司，批號14020213)。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備12只對照組大鼠正常飼料喂養。36只大鼠制作糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模型制備采用目前較為常用糖尿病潰瘍制作方法[7]。SD大鼠采用高脂高糖飼料喂養一個月，隔夜禁食后腹腔注射STZ 40 mg/kg，3 d后測空腹血糖大于16.7 mmol/L為造模成功。糖尿病大鼠造模成功后第5天，在所有大鼠(含正常對照組)背部較為平坦之處脫毛，龍膽紫標記約1.5 cm×1.5 cm面積，將該區域皮膚剪去，深達筋膜。

1.2.2分組與給藥 將實驗大鼠隨機分為正常對照組(NC)、糖尿病潰瘍組(DM)、糖尿病潰瘍-丹黃散組(DM-中藥)、糖尿病潰瘍-EGF組(DM-西藥),每組各12只大鼠；后3組大鼠制備糖尿病潰瘍模型，造模成功24 h后，DM組大鼠創面僅用碘伏消毒，DM-中藥組大鼠創面碘伏消毒后外敷“丹黃散”,DM-西藥組大鼠創面碘伏消毒后外敷重組人EGF凝膠；NC組大鼠潰瘍表面用碘伏消毒；各組大鼠背部潰瘍均用6層醫用小紗布(6 cm×6 cm)覆蓋，用醫用膠布包扎固定，每天換藥1次，觀察至潰瘍創面完全愈合，隔日創面拍照并記錄最終愈合時間。丹黃散用量參照臨床成人用量，根據徐叔云[8]的計算公式，大鼠等效劑量相當于人的9.1倍，得出大鼠丹黃散膏劑用量為2 g；重組人EGF凝膠用量也為2 g；敷藥面積均為超出創面邊緣0.2 cm，厚度為0.2 cm。

1.2.3潰瘍愈合率 造模后第1天、14天、28天測定大鼠潰瘍創面面積，采用快示格膠貼勾畫潰瘍場面輪廓線，置于白色背景 A4紙上，拍照，采用ImageJ計算其面積。創面愈合率(%)=(初始面積-當前測量面積)/初始面積×100%[9]。

1.2.4血清bFGF、EGF及VFGF水平檢測 干預后第14、28天，大鼠內眥取血，分離血清，按照bFGF、EGF及VFGF的酶聯免疫試劑盒說明書操作并制作標準曲線，每孔加待測樣本10 μL、樣品稀釋液40 μL，加酶50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌5次，顯色，終止，檢測OD450值,計算大鼠血清中bFGF、EGF及VFGF的含量，記錄實驗數據。

1.2.5Q-PCR檢測大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表達 干預后第14、28天取各組大鼠新生肉芽組織，提取RNA，采用Q-PCR法檢測大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGFmRNA的表達量。引物序列：EGF上游引物為5′-AAGATCGTAGAGCCAGGC，下游引為CCTCGATGCTCTGGT TTA-3′；bFGF上游引物為5′-TCCAGGCGTTCAAAGAAGAA-3′，下游引物為5′-CCATCAAGGGAGTGTGTGC-3′；VEGF上游引物為5′-GGCA GCTTGTAAACGAAC-3′，下游引物為5′-TGGTGACATGGTTAATCGGTC-3′。反應體系為：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL、PCR Forward Primer 0.8 μL、PCR Reverse Primer 0.8 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、dH2O 6 μL、DNA 模板2 μL,進行相對定量，實驗結果重復3次以上。

1.2.6Western Blot 檢測大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGF蛋白表達 干預后第14、28天取各組大鼠少量新生肉芽組織，提取蛋白定量后保存。配置10%的SDS-PAGE蛋白凝膠進行電泳，轉膜，封閉，隨后分別用bFGF、EGF、VFGF及β-actin的一抗室溫孵育2～3 h，用相應的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，超敏發光液顯色，Western Blot曝光儀中曝光。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 創面愈合情況

干預后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組及DM-西藥組大鼠背部創面愈合率均明顯提高，差異具有統計學意義(P<0.05)；干預后第28天，DM-中藥組創面愈合率高于DM-西藥組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：A為大鼠背部創面，B為干預第14天，C為干預第28天，(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖1 各組大鼠不同時間點背部潰瘍創面愈合情況及愈合率Fig.1 The effect of Danhuang powder on wound healing and healing rate of rat back ulcers at different time points

2.2 血清中bFGF、EGF、VEGF含量

干預后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量明顯提高(P<0.05)；干預后第28天，DM-中藥組大鼠血清中bFGF、EGF及VEGF含量高于DM-西藥組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF水平Tab.1 The effect of Danhuang powder on the levels of serum bFGF, EGF and VEGF

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05

2.3 背部潰瘍創面新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF mRNA表達

干預后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VEGFmRNA表達水平明顯提高(P<0.05)；干預后第28天，DM-中藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF及VEGFmRNA表達水平高于DM-西藥組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖2 各組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF mRNA表達水平Fig.2 The effect of Danhuang powder on the mRNA expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

2.4 背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF及VFGF蛋白表達

干預后第14、28天，與DM組比較，NC組、DM-中藥組、DM-西藥組大鼠背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表達水平明顯提高，差異具有統計學意義(P<0.05)；干預后第28天，DM-中藥組大鼠新生肉芽組織中bFGF、EGF、VEGF 蛋白表達水平高于DM-西藥組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

糖尿病潰瘍是糖尿病常見并發證之一，具有遷延不愈、反復發作等特點，給患者帶來極大的心理壓力和經濟負擔，是臨床急需解決的重要問題之一[10]。糖尿病潰瘍創面愈合的過程是多因子共同參與的。分子輔助治療糖尿病潰瘍過程中，bFGF、EGF和VFGF三者均扮演著重要的作用[11]。bFGF可直接作用于其靶細胞，通過促有絲分裂反應，使成纖維細胞分裂、增殖，起到促進創面愈合的作用。EGF是一種廣泛存在于人和動物體內的細胞因子，EGF受體存在于多種細胞膜上,受體與EGF結合后形成受體-EGF復合物,通過自磷酸化等一系列生化反應誘導或直接調控細胞增殖，從而啟動創面修復的過程[12]。VEGF是一種特異性作用于血管內皮細胞的多功能細胞因子,它不僅能引起血管通透性增加、細胞外基質成分改變，還能誘導新生血管形成[13-14]。

中藥的有效成分外用外治法是中醫治療糖尿病足的特色療法,在糖尿病潰瘍的研究中存在重要的臨床意義[15]。 丹黃散主要功效有活血化瘀、拔膿祛腐、托瘡生肌、利濕解毒等。方中丹參、大黃共為君藥，丹參不僅除了具有活血痛經、清心除煩、保護心腦血管等作用，還具備促進糖尿病潰瘍壞疽愈合、保肝、抗腫瘤、抗心肌缺血等作用[16]; 大黃的有效成分不僅具有抗腫瘤、輔助治療糖尿病腎病的作用，還可以保護膿毒癥胃腸功能衰竭患者，與此同時其提取物對脂多糖誘導的內皮細胞損傷也具有一定的保護作用[17]；當歸為臣藥，能夠補氣活血，在抗腫瘤、糖尿病治療、血管性癡呆中發揮作用[18]；沒藥、沉香為佐藥，具有止痛、活血、抗菌消炎作用[19]；松香與丹參具有相似的促進糖尿病潰瘍創面愈合的作用為使藥[20]。

(1)與DM組比較，P<0.05；(2)與DM-西藥組比較，P<0.05圖3 各組大鼠背部潰瘍新生肉芽組織中bFGF、EGF、VFGF蛋白表達Fig.3 The effect of Danhuang powder on the protein expression levels of bFGF, EGF and VEGF in newborn granulation tissues

本研究應用將中藥丹黃散外敷于糖尿病大鼠潰瘍創面，利用中藥外治潰瘍，從實驗結果來看，糖尿病潰瘍組大鼠血清中bFGF、EGF、VEGF較正常大鼠顯著降低，使用丹黃散外敷后，在大鼠血清及新生肉芽組織中bFGF、EGF、VFGF因子表達水平升高，表明丹黃散能夠上調3者的表達進而促進潰瘍創面的愈合，且效果優于重組人EGF凝膠外敷。

綜上所述，本實驗使用中藥丹黃散外敷能促進于糖尿病大鼠潰瘍創面的愈合，可能是通過上調bFGF、EGF、VFGF的表達量的表達水平，促進成纖維細胞和新生毛細血管增殖,改善創面的血液循環,促進肉芽組織生長及肉芽組織在創面的填充,加快上皮細胞生長,最終加快創面愈合的進程。這為促進糖尿病潰瘍創面愈合的藥物開發提供了新的參考依據，也為丹黃散促進糖尿病潰瘍創面愈合的作用機制提供新的理論基礎。