載脂蛋白E基因多態性與主觀認知減退的相關性*

胡勇， 劉芳*

(貴州醫科大學 神經病學教研室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茲海默癥 (alzheimer’s disease，AD)俗稱老年癡呆癥，是一種病程緩慢的認知障礙性疾病，以腦內β-樣淀粉蛋白沉積、神經原纖維纏結為主要的病理生理學改變為特征[1]。研究表明，在中國>65歲的人群中，癡呆的患病率約4.98%～5.9%，隨著年齡的增長，癡呆和AD在中國的患病率顯著上升[2]。AD分為主觀認知減退(subjective cognitive decline，SCD)、輕度認知障礙期 (mild cognitive impairment，MCI)及癡呆期 (dementiaof Alzheimer’s type，DAT)3個階段[2-3]。Jessen等[4]提出，主觀認知減退是指個體自感存在記憶或者其他認知功能較前出現下降．但無客觀神經心理檢測缺損的證據。近年來SCD的相關研究成為認知障礙研究的熱點，腦脊液、結構或功能磁共振、甚至FDG-PET和PIB-PET均有報告證實SCD階段 確實存在AD相關病理改變[5]。多項研究證實載脂蛋白E基因(Apo lipoprotein E gene，ApoE)與AD及MCI 階段密切相關[6-7]，ApoEε4等位基因是阿爾茲海默癥發病的一個獨立危險因素。本文探討SCD患者與正常老年人的Apo E基因多態性，分析其與SCD的相關性,旨在為SCD的防治提供依據。

1 資料與方法

1.1 對象與入組標準

從2016年9月～2017年9月神經內科住院及門診就診患者中選取≥60歲SCD患者130例為SCD組，另選取同期體檢的健康人120例健康者為對照組；SCD組中男75例、女55例，60～83歲、平均(72.8±8.1)歲；對照組中男68例、女52例，61～85歲，平均(73.1±8.6)歲。兩組被檢者年齡、性別等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。SCD入組標準：(1)記憶減退主訴的評定采用Lam等[8]開發的中國記憶癥狀量表 (chinese memory symptoms scale，CMSS)，該量表包括“您是否經常遺忘物品的擺放位置”、“無法想起好朋友的姓名”、“對談話的內容無法想起”、“有主觀記憶問題”及“明顯感覺自己的記憶力比同齡其他老人差”5個條目，如果2個以上條目均回答有，則認為有主觀記憶減退；(2)認知功能的評定采用簡易智力狀態檢查量表及北京版蒙特利爾認知評估量表，兩量表均采用按文化程度校正的臨界分值標準，即MMSE得分中學或以上(受教育年限>6年)者≤24分則視為存在認知功能障礙、27～30分為正常，MoCA得分中學或以上(受教育年限>6年)者≤24分視為有認知功能障礙、≥26分認知正常(本研究以受教育程度為中學以上為對象進行對照研究，故以MMSE≥27分，MoCA≥26分排除認知功能障礙)；(3)日常生活能力量表(ADL)<26分，排除日常生活受損；(4)焦慮自評量表(SAS)<50分，抑郁自評量表(SDS)<53分，排除焦慮抑郁情緒對認知的影響；(5)符合納入標準。正常對照組入組標準：(1)無記憶減退主訴，(2)MMSE≥27分、MoCA≥26分。

1.2 方法

1.2.1標本采集 對兩組被檢者，均抽取晨起7時空腹外周靜脈血2 mL，采用3.8%檸檬酸鈉抗凝，將白細胞基因組DNA通過鹽析法提取，放置于-20 ℃的冰箱中儲藏。

1.2.2ApoE 基因多態性檢測 將提取出來的基因進行擴增，使用Primer Premier5軟件設計及并合成ApoE基因的引物，上游引物序列為5′-AGGAACAACTGACCCCGGT-3′，下游引物為5′-TGCTCCTTCACCTCGTCCA-3′。聚合酶鏈反應(PCR)體系50 μL，Prem Taq(Ex Tag Version)2.0D331A 12.5 μL，基因組 DNA0.3 μg，上下游引物(10 μmol/L)各1 μL，加滅菌蒸餾水定容至50 μL。PCR反應條件: 95 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火35 s，72 ℃延伸40 s，35個循環后，72 ℃繼續延伸6 min后降至4 ℃。PCR產物經純化回收試劑盒(上海生工生物工程技術服務有限公司SK1141) 純化后，對靶基因進行直接測序，采用的儀器是3730序列分析儀，得到不同ApoE基因型。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg 吻合度檢驗

兩組的ApoE基因型頻率及等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有較好的吻合度 (χ2=4.78、2.35，P>0.05) 。見表1。

表1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗Tab.1 Hardy-Weinberg genetic balance test

2.2 ApoE 基因型分布

分析兩組被檢者ApoE基因型多態性，最常見的基因型是ε3/ε3，SCD組為64.61%、對照組為67.86%，SCD組ε3/4(18.46%)及ε4 /4(6.15%)基因型頻率高于對照組(14.17%、0.90%)，差異有統計學意義(χ2=4.139、4.173，P<0.05)。見表2。

表2 SCD組與對照組被檢者ApoE基因型頻率分布Tab.2 Frequency distribution of ApoE genotypes in SCD group and control group

2.3 ApoE 等位基因頻率

比較兩組被檢者ApoE等位基因分布頻率可見，SCD組和對照組ε4等位基因頻率分別為17.69%、7.91%，兩組比較差異有統計學意義(χ2=4.421，P=0.036)，兩組被檢者ApoE等位基因頻率均以ε3最高(SCD組為75%，對照組為81.67%)，見表3。

表3 SCD組與對照組被檢者ApoE等位基因頻率Tab.3 Frequency distribution of ApoE allele in SCD group and control groups

2.4 ApoE 等位基因頻率風險

通過計算OR值估計ApoE基因與SCD的關系，結果證明ApoEε2、ε3 等位基因與SCD發病無顯著相關性。ApoEε4等位基因與SCD呈正相關性，見表4。對于年齡、性別混雜因素影響，在統計分析中進行了Logistic回歸校正，最大限度地控制了混雜因素影響。見表5。

表4 ApoE 等位基因頻率與SCD風險分析Tab.4 The risk analysis of the relationship between ApoE allele frequency and SCD

3 討論

認知功能損傷是AD的主要表現，其病因及具體的發病機制未明，在進行早期診斷時容易誤診和漏診，臨床治療上存在較大的困難和差異。最近的一項縱向研究表明SCD是未來認知功能障礙和認知障礙發展的預測因子[9]。臨床中，在老年人MMSE及Moca等相關認知量表評測上還沒有表現出明顯認知下降時，就針對患者的病情做出有效的護理和防治對延緩患者的病情蔓延和發展具有十分重要的意義，對早期預防阿爾茲海默癥及治療具有重大意義[10]。

多項臨床隨訪研究均證實SCD與AD的轉歸相關。Meta分析研究比較了28項SCD相關隨訪結果后發現SCD較對照組發展為癡呆的風險約2倍[11]。SCD發展為癡呆和MCI的年轉化率分別為2.3%和6.6%[12]。國外對 SCD 的研究已進入到概念的提出、評估方法的制定、SCD 行為的改變[13]，甚至是干預方法的探索[14]等方面。目前國內進行ApoE的多態性與MCI及AD相關性的研究較多，而比較與SCD相關性文章較少，這也是開展本項研究的意義所在。ApoE基因位點具有多態性這一結論是1975年一名外國的學者在進行電聚焦實驗時發現的。目前比較統一的說法是由于年齡、種族和區域的不同，ApoE等位基因的分布頻率也不同。ApoE的3種等位基因在自然人群的分布頻率為ε3占大多數，為70%～80%，ε2和ε4分別占5%～10%和10%～15%[15]。目前認為機體血清中的Ch和脂質的代謝受到ApoE基因的影響從而產生各種疾病。

為了進一步探討ApoE與SCD發病率之間的關系，本研究重點比較SCD患者與正常老年人的ApoE基因多態性。曾有相關研究對患者與健康受試者的ApoE基因數據進行回顧性分析，結果表明，SCD患者的ε4 基因頻率明顯增高，提示其可能與SCD患病存在相關性[16]。在本研究發現兩組Apo E基因型多態性相比，SCD組被檢者ε3/4(18.46%)及ε4/4(6.15%)基因型頻率高于對照組(14.17%，0.90%)(χ2=4.139,4.173，P<0.05)，ε3/ε3是最常見的基因型(SCD組為64.61%，對照組為67.86%)。在等位基因多態性分布頻率比較中，結果顯示SCD組和對照組被檢者ε4 等位基因頻率分別為 17.69%、7.91%，兩者比較差異具有統計學上的意義(χ2=4.421，P=0.036),ε3是最常見的等位基因，其中SCD組被檢者為64.61%，對照組為67.86%。這一結果支持ApoEε4基因與SCD患病存在可能聯系。

本研究通過風險分析提示ApoEε4等位基因與SCD呈正相關性(OR=1.922)，混雜基因校正后OR=2.011。攜帶 Apo Eε4 等位基因者患SCD的可能性是未攜帶者的2.24倍，推測ApoEε4等位基因可能是SCD患病的風險因子之一。有報道發現SCD的患病率與ε4 基因的個數呈正相關，家族性的SCD患者中隨著ε4基因的個數增加，SCD的患病率甚至可增至90%[17]，這與本研究結果相似。

綜上所述，ApoEε4基因是SCD患病的重要危險因素，ε4基因個數的增加會提高SCD的患病率。通過檢測ApoE等位基因，早期識別SCD，從SCD階段進行干預，國外一些相關研究表明，某些藥物及非藥物治療可能會有一定的作用，如神經節苷脂臨床試驗、對SCD患者進行冥想訓練及正念訓練(mindfulness training)，可能對SCD向MCI甚至AD轉化有一定的延緩作用[18-20]。