幽門螺桿菌菌落PCR的優化*

劉芳， 王彩霞， 綦廷娜， 吳芳草， 文學琴， 陳崢宏*， 崔古貞*

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 微生物學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004)

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是由澳洲醫師Warren和Marshall從胃黏膜組織樣本中培養并分離獲得的一種定植于胃黏膜上皮細胞表面的微需氧、革蘭陰性螺旋桿菌[1]。已有研究表明，慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤(MALT)的主要病因與H.pylori感染相關，胃癌的發生亦與其有密切聯系[2-3]。有研究表明，H.pylori的致病作用及所致疾病和進展與多種因素有關，包括細菌的毒力因子、細菌黏附與定植、宿主炎癥與免疫反應、氧化應激、細胞增殖與凋亡及細菌自身的基因多態性等[4-5]。目前診療指南均推薦確診為H.pylori感染者采用質子泵抑制劑(proton pump inhibitor，PPI)或(和)鉍劑聯合兩種抗生素的三聯或(和)四聯療法進行根除治療，常用抗生素有克拉霉素、阿莫西林、甲硝唑等。隨著抗生素的廣泛應用，H.pylori對常用抗生素的耐藥性日趨嚴重，導致H.pylori的根除效果不佳[6]，如果能明確H.pylori致病及耐藥的分子機制，則有望實現精準治療。開發快速簡便的分子生物學檢測方法是研究H.pylori感染機制的先決條件，菌落PCR檢測是一種從大量樣品中快速鑒定和分析目標基因型的實用方法，已應用于分子生物學的許多領域[7-8]，如基因擴增[9]、質粒構建、菌株鑒定[10-11]、分子診斷[12-13]等。菌落PCR方法只需要少量的菌細胞，不需要使用試劑盒提取基因組DNA作為PCR反應模板，既方便又經濟，已經被廣泛用于細菌[14-15]、真菌[16-17]和微藻[7]的鑒定。H.pylori生長緩慢，通常需要3～5 d才能形成典型的針尖狀菌落，使用常規菌落PCR方法擴增H.pylori基因，其效率低、不穩定、重復性差。因此，為了提高H.pylori菌落PCR的擴增效率，本研究選擇H.pylori大小不同的8種基因進行菌落PCR優化，擬在常規菌落PCR的基礎上開發一種快速、高通量、經濟且具有良好重復性的分子診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株、試劑及引物H.pyloriATCC 26695由山東大學病原生物學研究所饋贈，貴州醫科大學微生物學教研室傳代保存。無菌新鮮脫纖維綿羊血由鼎國生物技術有限公司代購，腦心浸液瓊脂(brain heart infusion agar，BHI)、H.pylori選擇性添加劑購自英國OXOID公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，2×Taq PCR Master MIX購自北京天根生化科技有限公司，瓊脂糖購自生工生物(上海)有限公司]，8對引物[16SrDNA[18]、cagA-U(細胞毒素蛋白基因A[19]的上游片段)、cagA-D(細胞毒素蛋白基因A的下游片段)、iceA[20- 21](表皮細胞接觸誘導基因A)、ureA[22-23](編碼尿素酶亞基基因A)、hetA(鞭毛合成相關基因)、ropN[24](σ54轉錄調控因子)和Hp0792(Fis家族轉錄調節因子)]由生工生物(上海)有限公司合成，見表1。

表1 8種基因引物序列Tab.1 Primer sequences

1.1.2主要儀器 PCR擴增儀(日本，BIO-Rad 10213型)，瓊脂糖凝膠電泳儀(北京市六一儀器制造廠, DYY-8C型)，凝膠成像分析儀(北京市六一儀器制造廠，WD-9413B型)，臺式高速離心機(上海安亭，TGL-16B)，超純水機(成都艾柯，DZG-303A)。

1.2 方法

1.2.1H.pylori26695的培養 接種H.pylori26695于BHI血瓊脂平板(含10%無菌脫纖維綿羊血)，37 ℃微需氧條件(10% CO2、5% O2、85% N2)培養2～3 d。

1.2.2細菌基因組DNA的提取及PCR擴增 用接種環刮取培養2～3 d的H.pylori的菌落于去離子水100 μL中，參照細菌基因組DNA提取試劑盒步驟制備基因組DNA。PCR反應體系為模板DNA 0.5 μL，2×Taq PCR Master MIX(12.5 μL)，正向和反向引物(各1.25 μL)，去離子水9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s、55 ℃退失30 s、72 ℃延伸1 min 30個循環；最后72 °C終延伸5 min。

1.2.3菌落PCR反應的優化 (1)將去離子水(10 μL)加入PCR管或96孔板中、使用無菌接種針或牙簽從血瓊脂平板上挑取培養2～3 d的單菌落、并重懸于去離子水中，(2)將PCR管或96孔板(含有10 μL幽門螺桿菌懸浮液)置于沸水中煮沸10 s，(3)將PCR管或96孔板快速轉移至冰上冷凍5 min，(4)將正向和反向引物(各1.25 μL)及2×Taq PCR Master MIX(12.5 μL)加入到PCR管或96孔板中、總反應體積為25 μL，(5)混勻后按基因組DNA的PCR反應條件進行擴增，(6)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。步驟如圖1。

2 結果

如圖1所示，PCR擴增幽門螺桿菌的8個基因均未顯示清晰條帶，陽性對照組(基因組DNA作為模板，泳道2)顯示單一清晰條帶，試驗組(菌落經煮沸裂解速凍作為模板，泳道3～6)條帶與陽性對照組一樣顯示單一透明條帶。

注：M為Trans2K Plus II DNA Marker，泳道1為陰性對照(菌落未經任何處理)，泳道2為陽性對照 (基因組DNA作為模板)，泳道3～6為試驗組(菌落經煮沸冷凍作為模板)圖1 菌落PCR擴增電泳圖Fig.1 PCR products for colony PCR amplification

3 討論

菌落PCR可從大量轉化子或平板樣本中方便、快速獲得目標基因，是一種常規分子診斷技術。對于決大多數革蘭氏陰性細菌(如大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌)，PCR過程中的預變性步驟可以快速破壞細菌細胞壁，使細菌染色體釋放到胞外，從而可用于PCR擴增的模板；對于多數革蘭氏陽性細菌(如金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌)，雖然其細胞壁較厚，有多層肽聚糖組成，但PCR過程中預變性的高溫條件仍然足以破壞其細胞壁，其染色體釋放到胞外用于PCR擴增的模板[25]。然而，對于多數真菌(細胞壁含幾丁質、殼多糖等)和放線菌，因其特殊的細胞壁結構或生長特性，利用常規菌落PCR方法進行分子鑒定仍存在一定的困難，需要對常規菌落PCR方法進行特定改造或優化[26]。

盡管H.pylori屬于常規的革蘭氏陰性細菌，然而，常規菌落PCR方法在H.pylori中應用時效果不明顯、穩定性較差，這可能與H.pylori的特殊生長環境(強酸環境)或特殊的細胞結構有關[27-28]，其具體原因尚不清楚。在本研究中，我們隨機選擇8個大小不同的基因，利用常規菌落PCR方法進行擴增，不能獲得擴增條帶，盡管在陰性對照組中可以看到一些基因(例如ropN或16SrDNA)的模糊擴增條帶，但亮度較弱不能用于進一步分析。而將H.pylori菌落進行煮沸裂解速凍后作為PCR模板，均可顯示出與陽性對照組相似的清晰條帶，表明煮沸裂解速凍法可以應用于H.pylori的菌落PCR擴增。

綜上所述，本研究優化的菌落PCR技術對于H.pylori的鑒定效果較好，有助于快速進行H.pylori的高通量分類，轉化體篩選和分子診斷。