艱難梭菌sigB基因簇CRISPR-Cas9敲除載體的構建及驗證*

陳相好， 蔡夢迪， 陳崢宏,2， 谷俊瑩， 文學琴， 洪偉， 崔古貞,2**

(1.貴州省普通高等學校病原生物學特色重點實驗室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州醫科大學 醫學檢驗學院， 貴州 貴陽 550004； 4.貴州省分子生物學重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

艱難梭菌是一種產芽孢、革蘭陽性厭氧梭菌，在土壤、水以及哺乳動物腸道等環境中廣泛分布[1]，是引起抗生素相關腹瀉、假膜性結腸炎的主要腸道病原體[1-3]。近年來，由于高致病性產毒菌株的出現(如ClostridiumdifficileBI/NAP1/027等)，艱難梭菌感染率持續增高[4-5]。研究表明，艱難梭菌株毒力與多種因素有關，包括TcdA、TcdB和ADP-核糖基化二元毒素；此外，黏附素Cwp66、鞭毛、纖維粘連FbpA、表面層蛋白SlpA等也參與了艱難梭菌的定植過程[6-8]，但是對其他毒力、定殖因子以及調控其產生的分子機制缺乏深入了解。sigma因子與RNA聚合酶核酶協同作用，協助RNA聚合酶識別DNA靶位點的啟動子序列，從而調控靶基因的轉錄[9-10]。在艱難梭菌中，有多個sigma因子參與多種代謝反應，可對多種環境變化做出應激反應，如饑餓、氧刺激、酸堿度、滲透壓、乙醇、抗生素、溫度、膽汁酸等，這些因素幫助細菌適應不同的環境[10-14]。sigB基因(Gene ID:4916093)編碼的sigma-B因子是一種重要的全局調控因子，其活性受到嚴格的調控；sigB基因與rsbV(Gene ID:4916091)、rsbW(Gene ID:4916092)基因位于一個基因簇，前后依次相鄰；rsbW(anti-sigma)與rsbV(anti-anti-sigma)和sigB(sigma-B)基因共同作用，調控sigma-B因子與RNA核心酶的結合，從而調控靶基因的轉錄[10]。CRISPR-Cas9技術是一種廣泛應用于細菌遺傳改造的基因編輯技術，在艱難梭菌的其他因子得到成功應用[15-16]。為了研究艱難梭菌sigma-B因子的功能，本研究嘗試構建rsbV、rsbW及sigB基因的CRISPR-Cas9敲除載體，為研究sigma-B因子在艱難梭菌毒力中的調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 大腸桿菌DH5α購自Takara公司，艱難梭菌(Clostridiumdifficile630，CD630)及拜氏梭菌(ClostridiumbeijerinckiiNCIMB 8052, Cbei)由美國奧本大學Wang Yi教授饋贈。

1.1.2試劑和儀器 細菌基因組提取試劑盒、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自北京天根公司，蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉、瓊脂糖、腦心浸液瓊脂(BHI)、Goldview I型核酸染料購自北京索萊寶公司，8000 Marker、2×Taq Master Mix、Trans Start FastPfu DNA polymerase購自北京全式金生物技術有限公司，限制性內切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司，引物由上海生物工程有限公司合成。儀器為SimpliAmpTM Thermal Cycler PCR儀、DYY-7C型電泳儀、WD-9413B凝膠成像分析儀、BTH-100雙控溫干式恒溫儀。

1.2 方法

1.2.1菌株培養 大腸桿菌DH5α在LB培養基中37 ℃培養，需要時加入30 mg/L的氯霉素；艱難梭菌在BHIS培養基于厭氧管中37 ℃培養(BHIS培養基為BHI加入5 g/L的酵母膏和0.1%的L-半胱氨酸)[15]。

1.2.2敲除載體引物的設計及構建質粒 利用基于Python語言設計的程序[17]，檢索rsbV、rsbW和sigB基因的潛在打靶位點，并獲得擴增gRNA及同源臂的引物序列(表1)。本研究所構建的質粒特征及來源見表2。

1.2.3敲除載體的構建 (1)利用細菌基因組提取試劑盒提取拜氏梭菌Cbei基因組，以gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物，Cbei基因組為模板進行gRNA序列的擴增，擴增條件為95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸1 min，共30個循環，PCR結束后進行瓊脂糖凝膠電泳，并回收特異性條帶。由于識別艱難梭菌CD630相應DNA靶位點的特異性序列已設計在相應的gRNA引物中(gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB)，因此以拜氏梭菌Cbei為模板進行PCR擴增的主要目的是獲得其內源性啟動子用于gRNA的轉錄。利用BtgZI限制性內切酶酶切pJZ23、PCR產物純化試劑盒純化后，用克隆試劑盒與擴增的gRNA序列進行無縫組裝，50 ℃反應15 min，通過轉化及菌落PCR獲得質粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB。(2)使用細菌基因組提取試劑盒提取艱難梭菌CD630基因組，并以其為模板，以rsbV-UF/rsbV-UR、rsbV-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR為引物分別擴增rsbV、rsbW、sigB基因的上游同源臂，再以rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物擴增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，瓊脂糖DNA回收試劑盒回收特異性條帶。(3)以rsbV、rsbW、sigB基因的上下游同源臂為模板，rsbV-UF/ rsbV-DR、rsbW-UF/rsbW-DR、sigB-UF/sigB-DR為引物進行重疊延伸PCR，擴增條件為95 ℃預變性 3 min，95 ℃ 變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共30個循環，瓊脂糖DNA回收試劑盒回收特異性條帶，與經過NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進行無縫組裝，通過菌落PCR鑒定得到敲除載體prsbV、prsbW、psigB。

表1 gRNA及同源臂的引物序列Tab.1 gRNA sequences and primer sequences

表2 本研究所構建質粒的特征及來源Tab.2 The features and sources of constructed plasmids

1.2.4質粒的轉化 取無縫組裝的連接產物2 μL轉入50 μL大腸桿菌DH5α感受態細胞中，冰上放置30 min，42 ℃熱激1 min，冰上冷卻5 min后加入LB液體培養基900 μL，于37 ℃ 180 r/min復蘇1 h，離心后取細胞沉淀涂布于LB固體培養基平板(含30 mg/L 氯霉素)，37 ℃過夜培養，菌落PCR進行鑒定獲得質粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB、prsbV、prsbW、psigB。

1.2.5敲除載體的驗證 以獲得的敲除載體prsbV、prsbW、psigB為模板，通過PCR及測序進一步驗證所構建的質粒。

2 結果

2.1 gRNA序列及同源臂的擴增

利用提取的拜氏梭菌Cbei基因組為模板，以設計的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進行PCR，如圖1A所示的PCR擴增結果表明成功擴增獲得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艱難梭菌CD630基因組為模板，以設計的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/ sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR引物分別擴增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，如圖2B所示的PCR擴增結果表明成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以獲得的上下游同源臂PCR產物為模板進行重疊延伸PCR，如圖3C所示的結果表明，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。

注：M為8 000 Marker，A中泳道1～3分別為gRNA-rsbV、gRNA-rsbW及gRNA-sigB，B中泳道1～2為rsbV基因0.6 kb 上游同源臂、泳道2為rsbV基因0.55 kb下游同源臂、泳道3為rsbW基因0.62 kb上游同源臂、泳道4為rsbW基因 0.55 kb下游同源臂、泳道5為sigB基因0.64 kb上游同源臂、泳道6為sigB基因的0.63 kb下游同源臂；C中泳 道1為rsbV基因1.1 kb同源臂、泳道2為rsbW基因1.1 kb同源臂、泳道3為sigB基因1.2 kb同源臂圖1 敲除載體gRNA序列及同源臂的擴增結果Fig.1 PCR products of gRNAs against rsbV，rsbW and sigB and homologous arms

2.2 敲除載體的構建及驗證

將擴增獲得的gRNA序列與BtgZI酶切的pJZ23質粒通過克隆試劑盒進行無縫組裝，通過菌落PCR驗證，獲得質粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，再將擴增獲得的同源臂與NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進行無縫組裝，通過菌落PCR驗證，獲得敲除載體prsbV、prsbW、psigB。圖2A為以提取的質粒prsbV、prsbW、psigB為模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進行PCR，結合測序結果，證實成功構建了敲除載體的gRNA序列；圖2B同樣以prsbV、prsbW、psigB為模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物分別擴增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分別成功擴增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通過與上游同源臂融合后再連接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB載體上的，因此本研究成功構建了敲除載體的上下游同源臂，測序結果也證實rsbV、rsbW、sigB三個基因的上下游同源臂均構建成功。

3 討論

CRISPR-Cas系統是細菌及古細菌在發展進化的過程中抵御外來侵害而建立起來的適應性自身免疫防御系統，基于此原理建立起來的CRISPR-Cas9基因編輯系統，屬于Ⅱ型CRISPR-Cas系統，該技術相比以前的鋅指核酸酶(zinc finger nucleases,ZFNs)技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技術，具有方便、簡捷及編輯效率高的優點[18]，被廣泛應用于多種原核生物及真核生物的遺傳改造，為相關生物的功能及機制等研究提供了技術保障，展現了非常廣闊的應用前景和潛力。由于抗生素的大量使用及艱難梭菌高毒力株的出現，使得艱難梭菌感染引起的嚴重程度、耐藥率、復發率均呈上升趨勢[19]。探究艱難梭菌的毒力因子、致病和耐藥機制及相關的分子調控機制等，有利于加深對艱難梭菌的認識，為艱難梭菌的防治提供基礎。

注：M為8 000 Marker，A中泳道1為gRNA-rsbV、泳道2為gRNA-rsbW、泳道3為gRNA-sigB，B中泳道1為rsbV 基因0.55 kb下游同源臂、泳道2為rsbW基因0.55 kb下游同源臂、泳道3為sigB基因的0.63 kb 下游同源臂，C為本研究所構建的敲除載體模式圖圖2 敲除載體的驗證Fig.2 Verification of constructed knockout vectors

本研究以艱難梭菌中sigB相關基因(rsbV、rsbW和sigB)為靶點，利用提取的拜氏梭菌Cbei基因組為模板，以設計的gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進行PCR，成功擴增獲得gRNA-rsbV、gRNA-rsbW、gRNA-sigB序列。利用提取的艱難梭菌CD630基因組為模板，以設計的rsbV-UF/rsbV-UR、rsbW-UF/rsbV-UR、sigB-UF/sigB-UR、rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/sigB-DR引物分別擴增rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的上游及下游同源臂。以獲得的上下游同源臂PCR產物為模板進行重疊延伸PCR，成功獲得rsbV、rsbW、sigB基因的同源臂。本研究再將擴增獲得的gRNA序列與BtgZI酶切的pJZ23質粒通過克隆試劑盒進行無縫組裝，通過菌落PCR驗證，獲得質粒pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB，將擴增獲得的同源臂與NotI酶切的pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB進行無縫組裝，通過菌落PCR驗證，獲得敲除載體prsbV、prsbW、psigB。以提取的質粒prsbV、prsbW、psigB為模板，gRNA-TY/gRNA-rsbV、gRNA-TY/gRNA-rsbW、gRNA-TY/gRNA-sigB為引物進行PCR，結合測序結果也證實成功構建了敲除載體的gRNA序列；同樣以prsbV、prsbW、psigB為模板，rsbV-DF/rsbV-DR、rsbW-DF/rsbW-DR、sigB-DF/ sigB-DR為引物分別擴增rsbV、rsbW、sigB基因的下游同源臂，分別成功擴增出rsbV、rsbW、sigB基因0.55 kb、0.55 kb、0.63 kb的下游同源臂，而下游同源臂是通過與上游同源臂融合后再連接到pgRNA-rsbV、pgRNA-rsbW、pgRNA-sigB載體上的。

綜上所述，本研究成功構建rsbV、rsbW、sigB三個基因的CRISPR-Cas9敲除載體，為后續突變株的構建及其功能研究奠定了基礎。