TSC1轉基因敲除小鼠動物模型的構建及敲除效果的初步研究

王 紅，蔣 莉，王 巖，許振凱，王威平，方 航， 孫 鵬,白曉春1，2，3，*

(1.南方醫科大學附屬第三醫院，廣東 廣州510630；2.廣東省骨科研究院，廣東 廣州510630；3.廣東省骨科醫院，廣東 廣州510630；4.吉林大學第一醫院 急診科，吉林 長春130021；5.吉林大學中日聯誼醫院科學研究中心，吉林 長春130033；6.南方醫科大學，廣東 廣州510515；7.中山大學腫瘤防治中心麻醉科，廣東 廣州510060；8.華南腫瘤學國家重點實驗室廣東 廣州510060；9.腫瘤醫學省部共建協同創新中心，廣東 廣州510060)

結節性硬化復合物1(Tuberous sclerosis complex1,TSC1)，是人類的一種抑癌基因，與哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(The mammalian target of rapamycin，mTOR)有著密切的聯系。目前研究發現，mTOR能整合細胞內外各種信號，是機體與細胞感受營養的信號通路[1]。TSC1位于mTOR信號通路的上游，對mTOR有一定抑制作用。既往研究主要集中mTOR信號通路對心腦疾病及腫瘤發病機制的探討，而近期實驗發現mTOR信號通路在骨骼發育過程中發生變化[2,3]，但機制仍未闡明。骨骼發育過程中，肢芽干細胞、軟骨細胞及成骨細胞是其主要構成部分，闡明3者與mTOR信號通路的關系，將為骨骼發育提供新視野。

本研究擬構建肢芽干細胞特異性TSC1敲除小鼠(Prx-1-Cre；TSC1flox/flox)、軟骨細胞特異性TSC1敲除小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)、成骨細胞特異性TSC1敲除小鼠(Osx-Cre；TSC1flox/flox)，為進一步研究mTOR信號通路調控骨骼發育的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗動物：TSC1-loxP小鼠(品系號：005680)、Prx-1-Cre小鼠(品系號：006361)和Osx-Cre小鼠(品系號：006361)均購自美國的The Jackson Laboratory。不可誘導Col2a1-Cre小鼠(品系號：003554)為軍事醫學科學院贈與。用于保種繁殖和階段性年齡相關的野生型黑背景C57BL/6小鼠，均購自南方醫科大學實驗動物中心。主要材料：瓊脂果糖、GelRed等。

1.2 方法

1.2.1小鼠繁殖與分組 在SPF級動物飼養室繁殖小鼠，溫度控制在25°左右，濕度保持70%左右。首先利用不可誘導Col2a1-Cre小鼠和TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出攜帶有雜合Col2a1-Cre和雜合TSC1-loxP位點的小鼠，基因型為TSC1flox/-Col2a1-Cre的F1代小鼠。待小鼠成年后，繼續與TSC1-loxP小鼠交配，繁殖出雜合Col2a1-Cre和純合TSC1-loxP位點的小鼠，基因型為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox的F2代純合子小鼠，此為軟骨細胞特異性敲除TSC1轉基因小鼠(Col2a1-Cre；TSC1flox/flox)。 同窩帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox小鼠分組為Col2a1-TSC1 CKO組，正常的小鼠(如Col2a1-Cre；TSC1flox/-，TSC1flox/flox)分組為正常組(Con組)。

用以上的繁殖方法可獲得帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠、帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子小鼠，并分組為Prx-1-TSC1 CKO組、Osx-TSC1 CKO組。

小鼠基因型鑒定引物序列：

Prx-1-Cre primer forward:5′-TCCAATTTACTGACCGTACACCAA-3′

Prx-1-Cre primer forward:5′-CCTGATCCTGGCAATTCGGCTA-3′

Col2a1-Cre primer forward:5′-GCATCGACCGGTAATGCAGGC-3′

Col2a1-Cre primer reverse:5′-GAGGGTCCAGCCCGAGCTACTT-3′

Osx-Cre primer forward:5′-CTCTTCATGAGGAGGACCCT-3′

怎么會是這樣呢？紫云一臉錯愕，掩面沖出辦公室，跟呆立在門外的水仙芝撞了一個滿懷。兩人先是一驚，不覺同時笑起來了。

Osx-Cre primer reverse:5′-GCCAGGCAGGTGCCTGGACAT-3′

TSC1 loxP primer up：5′-GTC ACG ACC GTA GGA GAA GC-3′

TSC1 loxP primer down：5′-GAA TCA ACC CCA CAG AGC AT-3′

反應體系的配置如下：

2×PCR mix10 μl上游引物 02 μl下游引物02 μl超純水02 μlDNA模板04 μl總體積20 μl

PCR反應程序：

Col2a1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③ 65℃ 40sec；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥10℃ hold。②到④為循環反應，循環數為37

TSC1 loxP程序：①94℃ 3 min；②94℃ 40sec；③65℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環反應，循環數為35

Osx-Cre程序：①94℃ 2 min；②94℃ 30sec；③60℃ 30sec；④72℃ 30sec；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環反應，循環數為35

Prx-1-Cre程序：①94℃ 3 min；②94℃ 30sec；③60℃ 1 min；④72℃ 1 min；⑤72℃ 2 min；⑥04℃ hold。②到④為循環反應，循環數為35

瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因：吸取7-8 μl樣品加入瓊脂糖凝膠上樣孔中，常溫下恒壓160V 電泳約15-20 min，紫外投射儀下觀察并拍照。

1.2.3免疫組化 在出生后8周處死小鼠后取脛腓骨標本，固定并用石蠟包埋后，制作成石蠟切片，收集的新鮮組織標本石蠟切片，進行一抗p-S6過夜孵育，二抗37度孵育1 h，DAB顯色觀察。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 轉基因小鼠大體外觀及體長分析

各轉基因小鼠繁殖比較順利，均獲得相應的帶Cre的TSC1純合小鼠。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比，Prx-1-TSC1 CKO組小鼠瘦小。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比，Col2a1-TSC1 CKO組小鼠弓形駝背。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比，Osx-TSC1 CKO組呈方顱畸形(圖1)。

A為轉基因小鼠繁殖策略；B為8周齡大小鼠的大體外觀。(放大倍數為10X和40X)

2.2 轉基因小鼠的鑒定分析

RT-PCR實驗基因鑒定結果：圖2為出生后3周各小鼠的基因鑒定結果。1號為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/ flox純合子；2號為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/flox純合子；3號為不帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子；4號為帶Prx-1-Cre的TSC1flox/-雜合子；5號、6號為不帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子；7號為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/-雜合子；8號為帶Col2a1-Cre的TSC1flox/flox純合子；9號、11號為帶Osx-Cre的TSC1flox/-雜合子；10號為帶Osx-Cre的野生型小鼠；12號為帶Osx-Cre的TSC1flox/flox純合子。

圖2 小鼠基因DNA及Cre重組酶的PCR鑒定結果

RT-PCR實驗結果顯示：TSC1-loxP的PCR產物為230 bp和193 bp，TSC1純合子只有230 bp條帶，野生型小鼠則只有193 bp條帶，而雜合子則有230 bp和193 bp 條帶。Prx-1-Cre的PCR產物為550 bp條帶，Col2a1-Cre的PCR產物為358 bp條帶，Osx-Cre的PCR產物為430 bp條帶(圖2)。

2.3 轉基因小鼠軟骨與骨組織的免疫組化分析

取8周齡大的小鼠膝關節進行免疫組化p-S6染色。Prx-1-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在關節軟骨面的軟骨細胞和軟骨下骨骨小梁的成骨細胞，而且明顯升高。Col2a1-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在關節軟骨面的軟骨細胞，而且明顯升高。Osx-TSC1 CKO組與Con組相比，其p-S6的主要表達位置集中在髓腔骨小梁的成骨細胞，而且明顯升高(*，P<0.05；**，P<0.01)(圖3)。

3 討論

正常情況下，骨骼發育過程是需要多種細胞參與，如間充質干細胞、軟骨細胞、成骨細胞等。其中間充質干細胞早期可分化成肢芽干細胞，在骨骼形成中有著密切關系，是修復骨缺損的重要細胞來源。軟骨內成骨的過程中，間充質細胞或者肢芽干細胞形成致密體，致密體內細胞分化為軟骨細胞，然后軟骨細胞開始停止增殖，表達肥大軟骨細胞特異性表達的X型膠原，后分化為成骨細胞，使之分泌骨基質，最終形成骨領[4]。在此過程中，如肢芽干細胞發育異常，則直接影響骨骼發育，導致身體機能嚴重受限。如軟骨細胞發育異常，則發生軟骨發育不全，導致侏儒癥或者骨關節炎[5]。如成骨細胞發育異常，則發生骨質疏松癥或者脆骨病等[6]。mTOR是一個調節細胞生長與代謝的信號通路，參與調節蛋白合成、細胞生長、分化、增殖及凋亡[7,8]。其對骨骼發育的重要作用[9]已逐漸成為研究的熱點。但是，大多數的研究結果均得不到一致的結果，甚至互相矛盾，對其發育機制仍有爭議。有些觀點認為，mTOR信號通路是促進成骨分化[10]；而黃彬[11]等認為，mTOR信號通路是促進成骨增殖，抑制成骨分化。在我們的研究中，不管在軟骨細胞，還是成骨細胞，Con組小鼠的mTOR活性均比Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組小鼠明顯降低，說明在正常情況骨發育過程下，mTOR活性保持低表達；而mTOR活性高表達，則引起相應的骨骼疾病，如侏儒癥、方顱畸形等。因此，從肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞上探討mTOR信號將成為結果骨骼發育異常的新策略。

Cre/loxP系統是目前應用較多的基因敲除模型，在國內外已經得到廣泛推廣。該系統主要由Cre重組酶和loxP位點組成，Cre重組酶具有一定的催化活性，并且與限制酶有一定相似之處，能識別特定的DNA序列，如loxP位點，引起內外源基因敲除、失活、激活、插入、倒轉、易位等[12,13]。在肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞上敲除TSC1基因，將有望構建肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞mTOR活性激活的轉基因小鼠，對研究骨骼發育異常提供良好的動物模型。按照轉基因繁殖方法[14]，我們得到了相應的Prx-1-TSC1 CKO組、Col2a1-TSC1 CKO組和Col2a1-TSC1 CKO組小鼠各8只，其敲除效果明顯： Prx-1-TSC1 CKO組集中在關節軟骨和軟骨下骨骨小梁；Col2a1-TSC1 CKO組，集中在關節軟骨，引起脊柱弓形駝背；Osx-TSC1 CKO組，集中在髓腔骨小梁，引起方顱畸形。

圖3 轉基因小鼠的p-S6分布結果

A為Prx-1-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關節軟骨和軟骨下骨p-S6的表達，B、C分別為其關節軟骨、骨小梁p-S6表達統計分析；D為Col2al-TSC1 CKO組與Con組小鼠的關節軟骨p-S6的表達，E為其關節軟骨p-S6表達統計分析。F為Osx-TSC1 CKO組與Con組小鼠的髓腔骨小梁p-S6的表達，G為其骨小梁p-S6表達統計分析。(放大倍數為200X和400X)

綜上所述，本實驗中成功構建了肢芽干細胞、軟骨細胞、成骨細胞特異性敲除TSC1轉基因小鼠，首次從骨骼發育各階段中繁殖出相應的mTOR活性激活小鼠，為進一步探討骨骼發育缺陷提供新的研究靶點和新認識，為臨床骨科相關疾病提供新的理論基礎。