體內實驗檢測紅景天甙對SACC-2細胞的影響

張曉恬,王醫術,林佳慧,楊 格,李美華*

(1.吉林大學第二醫院 口腔科，吉林 長春130041;2.吉林大學 病理生物學教育部重點實驗室,吉林 長春130021)

化學治療(chemotherapy)仍然是當前抗腫瘤臨床治療的重要方式之一。紅景天作為一種廣泛分布于我國境內的天然中草藥植物，其根內可提取出多種具備廣泛藥理作用的有效成分，目前認為紅景天具備抗炎、抗活性氧化、抗心血管疾病、抗腫瘤及調節免疫水平等多種作用，紅景天甙作為提取物中關鍵的活性成分之一，研究、運用較為廣泛[1,2]。已有研究表明紅景天苷能夠通過下調Bcl-2的表達水平誘導人乳腺癌細胞的細胞周期停滯和凋亡，也可以通過增加脾淋巴細胞轉化率和IL-2值來明顯抑制人胃癌細胞系BGC-823的生長[3,4]。但查新結果表明：當前國內鮮有關于紅景天抗唾液腺腫瘤的相關系列研究。

唾液腺腺樣囊性癌(saliva adenoid cystic carcinoma SACC)作為唾液腺最常見的惡性腫瘤之一，好發于腮腺及腭部小腺體。腺樣囊性癌具有較強的浸潤性，且好沿神經生長，或累及血管引發血行性轉移，遠端轉移率在口腔頜面部惡性腫瘤中居首位[5]。如何利用紅景天甙的抗腫瘤作用，為唾液腺腺樣囊性癌的抗腫瘤序列治療提供新的藥物選擇，是口腔頜面外科抗腫瘤化療的研究熱點之一。

本研究擬利用荷瘤裸鼠動物模型探究紅景天甙藥物治療對SACC-2細胞的影響，為臨床開發安全有效的抗SACC紅景天中藥制劑提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

雄性裸鼠20只，18-20 g左右，隨機分配為4組，每組5只，由吉林大學基礎醫學院動物實驗中心提供，術前適應性飼養1周。

1.2 實驗材料

人唾液腺腺樣囊性癌細胞SACC-2 (SIBCB，上海) ，紅景天甙 (吉林大學基礎醫學院，長春)，HE染色液(The Key Laboratory of Pathology and Biology,Ministry of Education，長春)，數碼顯微照相裝置(The Key Laboratory of Pathology and Biology,Ministry of Education，長春)。

1.3 紅景天甙的提取

取實驗室培植的紅景天根，洗凈，切段；烘干；研磨粉碎；加入重蒸水，置入微波爐中微波；60℃超聲提取；重蒸水定容；抽濾，檢測備用。

1.4 動物模型建立

裸鼠適應性飼養一周后，于裸鼠右側腹股溝處行皮下注射SACC-2細胞，注射細胞量為3×106/只。種瘤第2天對4組裸鼠進行不同的治療處理：第一組為紅景天甙處理組，通過腹腔注射紅景天甙溶液對裸鼠進行治療，紅景天甙濃度為20 mg/kg；第二組為5-Fu處理組，通過腹腔注射5-Fu溶液對小鼠進行治療，5-Fu濃度為15 mg/kg；第三組為聯合用藥組，通過腹腔注射紅景天甙和5-Fu對小鼠進行治療，紅景天甙濃度為20 mg/kg，5-Fu濃度為15 mg/kg；第四組為生理鹽水(Normal Saline，NS)處理組，使用NS通過腹腔注射的方式對小鼠進行治療。治療時間自種瘤第2日開始，治療為每2天一次，共進行5次治療。

1.5 標本處理

按時處死裸鼠，取其皮下腫瘤組織，PBS清洗，取小于0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm的組織塊備用；組織塊置入中性福爾馬林固定液(10%)，完成后石蠟包埋、切片；將厚3-5 μm的切片貼附于經P-L-L附膜的載玻片上，65℃烘烤4.5 h，備用。

1.6 HE染色

(1)切片脫蠟至水洗；(2)蘇木精染色5 min，自來水洗；(3)鹽酸酒精分化，自來水洗；(4)弱氨水反藍，自來水洗；(5)伊紅染色15 min，自來水洗；(6)系列ET及Xyl脫水透明，中性樹膠封片；(7)顯微鏡觀察、拍照。

1.7 免疫組織化學染色

(1)切片脫蠟至水洗；(2)抗原修復，置入0.01M(pH 6.0)CPBS于電磁爐上熱修復5 min；(3)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(4)滴加3%的H2O2(Endogenous Peroxidase Blocking Solution)，室溫孵育15 min;(5)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(6)滴加二抗同種動物非免疫血清封閉，室溫15 min；(7)免洗，去血清，分別滴入制備好的一抗4℃過夜；(8)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(9)滴加生物素化二抗，室溫15 min；(10)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(11)滴加HRP-Avidin，室溫15 min；(12)0.01M(pH 7.2)磷酸鹽緩沖液洗5 min×3次；(13)新鮮配制的DAB、AEC溶液顯色3-10 min；(14)清水蕩洗，蘇木精淡染胞核，分化。清水蕩洗，返藍，系列ET及Xyl脫水透明，中性樹膠封片；(15)顯微鏡觀察、拍照。

1.8 細胞增殖指數計算

Ki67陽性染色主要分布于細胞核中，呈棕黃色或棕褐色。隨機選取3個不同的區域，每個區域隨機計數50個細胞，計算陽性率(增殖指數 PI%=陽性細胞數/細胞總數×100%)。

1.9 統計學方法

數據運用SPSS17.0統計軟件包處理，增殖指數的比較用χ2檢驗統計，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物對腫瘤形態的影響

HE染色顯示含瘤組織細內胞形態的改變情況。結果顯示，NS組細胞內細胞核異型性大，核染色較深，紅景天甙組、5-Fu組和聯合用藥組腫瘤細胞內細胞核異型性較小，核染色相對淺，其中聯合用藥組核染色最淺，細胞核異型性最小(圖1)。

2.2 藥物對SACC-2細胞增殖的影響

免疫組織化學(immunohistochemistry，IHC)染色檢驗目標組織內Ki-67的表達情況。結果顯示，NS組Ki-67陽性表達細胞多，陽性率高，聯合用藥組表達細胞最少，陽性率低，紅景天甙組Ki-67表達的陽性率低于聯合用藥組(圖2)。

A：NS組 B：5-FU組 C：聯合用藥組 D：紅景天甙組

A：NS組 B：5-FU組 C：聯合用藥組 D：紅景天甙

2.3 藥物對SACC-2細胞增殖指數的影響

對免疫組化結果進行統計學分析，計算增殖指數。結果顯示生理鹽水組增殖指數最高，5-FU組及紅景天甙組增殖指數顯著降低(P<0.01)，二者聯合應用增殖指數最低(表1)。

表1 各組細胞的增殖指數

各組間比較P<0.05

3 討論

健康組織與其來源的腫瘤組織在組織結構和細胞形態上存在的差異程度稱為異型性(atypia)，這種差異是臨床病理組織學中良、惡性腫瘤的重要診斷依據，也可用腫瘤組織的分化程度來表示。低異型性意味著腫瘤組織具有較高得分化水平，臨床預后也相對良好。因此，在有藥物治療干預的情況下，可以通過觀察腫瘤組織細胞異型性的改變來反應藥物對腫瘤的治療作用。Ki-67是與細胞增殖存在相關性的一種核抗原，由德國Kiel市的學者發現而得名，其表達基因位于人的10號染色體,Ki-67免疫組織化學染色可以標記除細胞增殖周期中G0期以外的所有時期的細胞，因而也成為細胞的增殖指數[6,7]。同時由于其較短的半衰期，可以準確反映細胞的增殖活性，因此已廣泛運用于包括腺樣囊性癌在內的多種腫瘤增殖活性檢測[8-10]。

在本研究中，利用HE染色觀察不同藥物處理組的組織內腫瘤細胞形態的改變，免疫組織化學染色檢測紅景天甙處理對SACC-2細胞增殖的影響和對SACC-2細胞凋亡相關蛋白Ki-67表達水平的影響，進而反應紅景天甙作用于SACC-2細胞時的藥理作用。HE結果顯示，HS組腫瘤細胞內胞核異型性大，核染色較深，紅景天甙組、5-Fu組和聯合用藥組腫瘤細胞內細胞核異型性及胞核染色程度均低于生理鹽水組，表明紅景天甙對裸鼠體內的SACC-2細胞具有抑制作用，能夠降低其惡性程度，改善預后。免疫組化染色結果則顯示NS組Ki-67陽性表達細胞多，陽性率高，而聯合用藥組表達細胞最少，陽性率低。進一步證實了紅景天甙對SACC-2具有抑制作用，且這種調控是通過抑制增殖作用完成的。此外，HE染色顯示聯合用藥組細胞核異型與胞核染色程度低于紅景天甙組，IHC染色檢測則表明紅景天甙組陽性率低于聯合用藥組，考慮這種差異的出現可能為聯合用藥時5-Fu會降低紅景天甙對SACC-2細胞Ki-67表達水平的抑制作用，其具體機制仍有待進一步研究。

本研究通過建立荷瘤裸鼠動物模型，進一步證實了紅景天甙對SACC-2細胞具有抑制作用，且這調控是通過抑制增殖作用完成的，為臨床研發用于抗唾液腺腺樣囊性癌治療的紅景天中藥制劑提供相應的理論依據。