阿片受體OPRK1基因甲基化與阿爾茨海默癥易感性的關系

孔祥怡，杜建時，叢樂樂，趙 晴

(吉林大學中日聯誼醫院 1.血管外科；2.皮膚科；3.南湖院區神經內科，吉林 長春130033)

阿爾茨海默病(AD)是癡呆綜合征最常見的一種，老年人多發，其特征在于不可逆的記憶喪失和認知能力下降[1]，臨床表現為進行性記憶障礙、視空間技能損害、執行功能障礙、人格和行為改變等，是60%-70%的老年癡呆癥的潛在原因[2]。阿爾茨海默病的發病機制非常復雜，可能與遺傳、環境密切相關[3]，而基因的甲基化作為作為其發病機制的一個部分，在阿爾茨海默病的起病過程中起著不可忽視的作用[4,5]。OPRK1作為阿片類受體基因，在人類的記憶、學習過程發揮重要作用，該基因的甲基化依靠調控基因表達促使阿爾茨海默病發病。本實驗通過探討外周血中OPRK1基因啟動子區甲基化與AD發病風險的相關性，為阿爾茨海默病患者的早期診斷及治療提供指導意見。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象 所有病例均取自2015年10月-2017年12月吉林大學中日聯誼醫院認知功能障礙門診及神經內一科病房收入院的患者，AD組為老年阿爾茨海默病患者，同時選取我科門診就診患者既往無重大疾病，目前無急癥的非AD患者為對照組。研究對象共例AD組45例，對照組55例。此項目已在我院倫理委員會批準立項，入組患者對項目知情并簽署知情同意書，兩組間基線資料對比無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。納入標準：全部患者符合美國精神病學會的精神障礙診斷和統計手冊第4修訂版(DSM-IV)中AD的診斷標準；排除標準：(1)合并其他類型癡呆的患者，(2)患有嚴重原發性疾病患者，(3)有精神病史患者，有腦卒中、頭外傷患者。

1.1.2標本收集 EDTA管留取患者清晨空腹血樣，3 000 g×10 min離心，小心吸取中間白細胞層，編號，-80℃保存樣本。

1.2 方法

應用Wizard Genomic DNA Purification Kit試劑盒，嚴格按照說明書進行DNA的提取。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit試劑盒，(購于德國Qiagen公司)，嚴格按照試劑盒說明書進行DNA的亞硫酸氫鹽處理。以亞硫酸氫鹽處理后的DNA模板為樣本，利用甲基化及非甲基化引物通過PCR擴增儀進行擴增。總反應體系25 μl，DNA模板1 μl，EpiTect Master Mix12.5 μl，RNase-free water 10.5 μl，甲基化及非甲基化引物各0.5 μl。PCR反應條件為95℃預變性10 min，94℃變性15 s，55℃退火30 s，共40個循環，最后72℃延伸10 min，4℃

保存，取5 μl PCR產物、1 μl Loading Buffer，通過綠如藍核酸染料進行染色，在3.0%瓊脂糖凝膠中上樣，120V電泳，在全自動凝膠成像系統GelDocXR+下顯像。OPRK1基因以甲基化引物(M)出現產物條帶判斷為陽性，非甲基化引物(U)出現產物條帶判斷為陰性，當甲基化引物出現產物條和非甲基化引物同時出現產物條帶判斷為陽性。

1.3 統計學分析

采用SPSS20.0統計軟件處理對計量資料進行方差齊性檢驗，相關性分析采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 OPRK1基因甲基化結果

AD組OPRK1基因啟動子區甲基化率明顯高于對照組，經統計學分析，兩者比較，χ2值=22.37，P<0.05，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 OPRK1基因甲基化結果

注：χ2=22.37；P<0.05.

2.2 MSP擴增產物凝膠電泳圖

圖1.1示：AD組U出現產物條帶，部分M出現產物條帶；圖1.2為對照組，M及U均出現產物條帶，既存在甲基化改變，又存在非甲基化改變。

注：Marker:2000 bp DNA； U:unmethylation ； M:methylation

3 討論

脫氧核糖核酸甲基化是基因調控常見的表觀遺傳學之一，脫氧核糖核酸甲基化是將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶的一種反應[6]。表觀遺傳修飾包含脫氧核糖核酸甲基化、組蛋白修飾和微小核糖核酸。甲基化能夠影響脫氧核糖核酸與蛋白質相互作用方式，進而改變基因的表達形式[7,8]，不同基因的甲基化可能從多方面影響癡呆的發生。

OPRK1基因編碼阿片受體，基因發生甲基化與阿爾茨海默病的發病可能有一定的關系，被認為是治療神經疾病的藥物靶點，在認知障礙的發生過程中起著關鍵作用[9]。阿片受體主要分布在海馬區域[10]，它利用神經保護作用，減少β-淀粉樣蛋白的生成，影響阿爾茨海默病的發病[11,12]。隨著老齡化社會的到來，阿爾茨海默病的人群患病率逐年上升，阿爾茨海默病的發病機制至今仍很不明確，早期的診斷尤為困難，給患者本人、家庭、社會帶來了沉重的負擔，所以對阿爾茨海默病發病機制探索，從分子生物學水平有大量的研究證明，阿爾茨海默病的發病與脫氧核糖核酸甲基化密切相關[13]。

脫氧核糖核酸的甲基化可能造成神經退行性疾病發生，本次研究中，阿爾茨海默病組的基因甲基化率明顯高于健康對照組，OPRK1基因啟動子區發生甲基化改變阿爾茨海默病組的患者檢測出共有31(68.89%)例患者，而在健康對照組中只有12(21.82%)例患者發生改變，JiHuihui等人也作出了同樣的結果[14]。性別是阿爾茨海默病發病風險的一個重要因素，有研究表明基因組甲基化在男、女之間有一定的區別[15]，本次研究顯示阿爾茨海默病OPRK1基因甲基化與男女性別無相關性，這個結果可能需要更多的實驗研究闡明性別對表觀遺傳變化的影響，基于分子、細胞和小鼠動物模型等多個層次系統的研究都取得了豐碩的成果[16]。

目前，隨著基因檢測技術的不斷進步，與阿爾茨海默病發病相關的易感基因的甲基化狀態被逐漸被人類發現，可以在早期發現這些易感基因的改變，從而建立一個易感基因譜，為疾病的早期診斷、早期治療提高科學的依據。