應用蛋白質芯片CM10檢測弱精子癥患者精漿標志物

徐建新 呂勝啟 朱 濤 方登攀

1.江漢大學附屬醫院泌尿外科（湖北武漢 430015），2.武漢大學人民醫院泌尿外科（湖北武漢 430060），

弱精子癥是男性不育最常見的疾病之一，但其發病機制尚不十分清楚，阻礙了弱精子癥臨床診斷和治療的進展。蛋白質芯片可以篩選出生物標志物已經取得階段性進展，因此針對精液異常的弱精子癥患者，我們采用CM10芯片結合蛋白組學技術對精漿樣本進行檢測及統計分析，確立與弱精子癥發病機制相關的重要蛋白，是探尋男性不育原因的一條新思路，這將為探討弱精子癥的診療研究提供重要依據。

資料和方法

一、臨床資料

所有標本均于2017年3月～2017年12月取自江漢大學附屬醫院檢驗醫學中心，按世界衛生組織診斷標準行3次精液常規分析后，選取結果符合弱精子癥診斷標準者45例，為弱精子癥（RJ）組，平均年齡33歲。對照組38例，年齡25-38歲，來源于正常健康男性自愿者捐獻的精液標本，為正常（N）組；研究對象采集精液前禁欲5～7d，待標本完全液化后，按精子分析儀對標本進行檢測，測定精液標本的顏色、pH值、精子計數、精子活力、液化時間、及畸形率等。精液標本放入無菌離心管中，離心分離精漿，取上層精漿標本1～3mL裝入Ep管中，快速置入液氮冷凍保存。

二、研究方法

（一）精漿標本處理

從液氮罐中取出精液樣品，冰凍精漿冰上融解；離心（42×g,4℃）5min，取上清液備用；取 20μl U9 緩沖液（1%DTT,9mol/L 尿素，2%CHAPS）加入 10μl精漿置入EP管中，并將樣品充分混勻，冰浴振蕩30min（500r/min）； 在 160μl的 50mmol NaAC,pH4 結合緩沖液中加入40ul上述變性的樣本，4℃保存備用。

（二）芯片處理

取出CM10的芯片，在芯片背后標記操作者的姓名、時間，芯片種類等資料，將芯片經10mol/LHCL活化處理10min，再用結合緩沖液(50mM NaAC,pH4.0)處理10min，將芯片裝入生物芯片處理器。再用振蕩器輕微震動芯片5min，甩掉緩沖液。重復上述操作一次。將100μl處理好的樣品加入在芯片處理器每個孔中，置振蕩器(MS1Minishaker)42×g,室溫孵育 1h。

（三）上機檢測

每孔加入50mmol/L NaAc結合緩沖液200ul，置振蕩器(MS1 Minishaker)42×g震蕩5min，取出芯片風干，每孔加入SPA飽和液0.5μl，5min后重復加入SPA飽和液0.5ul，芯片干燥后即可上機測定。

三、蛋白質指紋圖譜

利用NP20芯片對TOF質譜儀進行校正，采用激光源強度為160，檢測器靈敏度為8，真空度為8.387e-007 Torr，最高掃描分子質量Mr50000Da，最低分子質量為1000。所有芯片按照上述條件檢測。

四、統計學處理

篩選符合正態分布的樣本采用Ciphergen protein chin software分析兩組樣本的相關性，所有數據均經SPSSl6.0統計軟件包處理，兩組樣本比較采用t檢驗，P＜0.05時為差異有顯著性。

結 果

用CM10芯片結合蛋白質芯片-飛行時間質譜技術對兩組精漿樣本進行比較分析，捕獲兩組標本的蛋白質指紋圖譜。

在CM10蛋白質芯片上共檢測到118種有差異的蛋白峰，弱精子癥組較正常組有2處蛋白峰表達降低，差異有顯著性（P＜0.05），其中 M/Z 為 6811.14、15520.4；弱精子癥組較正常組有2處蛋白峰表達增高，差異有顯著性（P＜0.05），M/Z 為 2760.30、14772.0，見表 1。

表1 弱精子癥（RJ）組與正常(N)組精漿中差異蛋白質列表（x±s）

表2 CM10蛋白質芯片篩選到的弱精子癥差異蛋白

討 論

弱精子癥是指精液參數中前向運動的精子（a和b級）小于50%或a級運動的精子小于25%的病癥，故又稱為精子活力低下。男性不育是嚴重的社會及醫學問題[1]，這一疾病嚴重困擾著患者和醫生，而弱精子癥是引起男性不育的重要因素之一，文獻報道，因精子活力低下而導致的男性不育約占所有男性不育致病因素的50%[2]。弱精子癥的發病機制十分復雜，涉及到精子運動結構和功能的異常、信號傳導通路異常等因素。臨床上弱精子癥的治療困擾著臨床醫師，各種經驗性的治療用來改善精子活力，但療效甚微。研究發現，導致精子活力下降與蛋白質酪氨酸磷酸化、染色體異常、精漿異常、精索靜脈曲張、內分泌因素、生殖道感染等很多因素相關[3，4]。精液質量與微量元素含量的變化有關，酶活性降低或酶類缺乏與精子運動也有關系，兩者都可以引起精子受精能力低下。精子活力對于男性生育力的維持至關重要，但目前對于弱精子癥患者精漿中蛋白質的變化及其生物學功能的基礎研究甚少。

圖1 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z2760.30）

圖2 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z14772.0）

圖3 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z6811.14）

蛋白質芯片-飛行時間質譜技術（SELDI-TOF-MS）是一種對所有蛋白質進行分離、圖譜化、鑒定，探尋疾病的生物標志物、藥物靶點具有高度靈敏度、自動化、微型化的檢測工具[5]。通過檢測蛋白質的分子質量進而對蛋白質分子的修飾、蛋白質分子的鑒定來進行研究，可以探究蛋白質的細胞定位和信號傳遞與調控作用，闡明相關疾病的分子機制。運用蛋白組學技術對精漿中差異蛋白質進行研究，可以為精子的受精能力、發育、運動等相關研究提供有利線索，可望對于弱精子癥的診斷和治療提供新的思路。

圖4 差異蛋白的指紋圖譜及差異蛋白凝膠狀示意圖（M/Z15520.4）

目前，將蛋白質組學技術應用于男性不育的相關研究，可以篩查出差異表達蛋白用于疾病診斷、治療和預防的標志物，并且收到較好效果。楊歡等應用H4蛋白質芯片檢測少精子癥患者的精漿，發現有1處蛋白峰明顯降低，其相對分子量為M/Z11022.9，在SAX-2芯片上發現有1處蛋白質峰較正常生育男性精漿明顯升高，其分子量為M/Z16751.6[6]。Kempisty等對100例弱精子癥患者和70例正常生育男性精子中的PRM轉入水平進行研究，發現弱精子癥組PRM轉入水平較正常組顯著降低（P＜0.01）[7]。景曉瑋等利用聚合酶鏈式反應技術對弱精子癥患者精子中GRISP2基因進行研究，并認為GRISP2蛋白及基因是進一步研究弱精子癥的分子靶點[8]。Liu FJ等應用等利用SELDI-TOF-MS技術檢測了年老及年輕患者弱精子癥精液中PATE1蛋白質的差異性，發現PATE1蛋白是可能為弱精子癥發病機制的一個靶點[9]。Smith等[10]報道精子特異性的硫氧還蛋白Txndc2、Txndc3在保護精子細胞免受氧化應激損傷的過程中起到關鍵作用。

我們采用CM10蛋白質芯片結合蛋白組學技術對正常生育男性和弱精子癥患者的精漿蛋白質進行篩查，建立正常（N）組與弱精子癥（RJ）組精漿差異蛋白凝膠狀示意圖及指紋圖譜，并發掘弱精子癥患者中特異性的蛋白質標志物。通過實驗檢測到118種有差異的蛋白峰和弱精子癥相關，結果證實弱精子癥組較正常組相比存在著差異蛋白質，捕獲到的4種差異蛋白質有統計學意義，弱精子癥組精漿較正常組蛋白質譜相比有兩處蛋白質峰明顯降低，其中M/Z為6811.14、15520.4，差異有顯著性（P＜0.05）。較正常組有2處蛋白峰明顯增高，其分子量M/Z為2760.30、14772.0，差異有顯著性（P＜0.05）；說明精漿中這些差異蛋白質的含量變化很可能與弱精子癥的發病機制有著重要相關性，可以將這4種差異蛋白質作為弱精子癥臨床篩查的精漿標志物。其他學者也利用SELDI-TOF-MS技術篩查出了正常男性和弱精子癥患者精漿蛋中的一些差異蛋白質，這些實驗結果均有助于擴充蛋白質數據庫,有助于對其發病機制的進一步研究[11]。

但是，目前我們還不能直接給出這些差異蛋白質的生物學功能和結構等信息，若對所測蛋白質進一步分離研究，搜索相關數據庫，更深入的了解這些差異蛋白質的生物學功能本質，同時研究弱精子癥的信號傳導機制，最終有助于闡明弱精子癥的發病機制，并可望對弱精子癥的診療開辟新的途徑。