精子核蛋白組型轉化、精液參數(shù)、精子DNA損傷與復發(fā)性流產(chǎn)相關性研究

張海濤 劉德風 毛加明 張 哲 楊宇卓 ，4 張洪亮 ，4趙連明 林浩成 洪 鍇 姜 輝 ，4* 唐文豪 ，4*

1.北京大學第三醫(yī)院泌尿外科（北京 100191）；2.北京大學第三醫(yī)院男科；3.北京大學第三醫(yī)院生殖醫(yī)學中心；4.北京大學第三醫(yī)院人類精子庫

復發(fā)性流產(chǎn) (recurrent spontaneous abortion，RSA)是指連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，孕12周之前多見，又稱為早期復發(fā)性流產(chǎn)[1,2]，是妊娠期最常見的妊娠并發(fā)癥，其發(fā)生率為0.8%～1.4%[3]。復發(fā)性流產(chǎn)的病因比較復雜，臨床上即使進行了詳細的病因篩查，目前也只有大約50%的病例能查明原因[4]，這些已知因素主要包括遺傳、解剖學、高齡、內分泌、免疫、血栓形成、代謝及感染因素等[4-9]。

目前，針對RSA的病因研究主要集中在女性，男性因素研究較少。研究表明與RSA有明確相關的男性因素主要是染色體異常和精子DNA損傷，后者臨床上可以通過檢測精子DNA碎片指數(shù)（DFI）進行評估。眾所周知，胚胎的遺傳物質來自精子和卵母細胞，胚胎染色體異常或基因異常是導致RSA的主要原因[10,11]。此外，有些學者[12-14]認為精子DNA損傷也可能影響胚胎發(fā)育并導致流產(chǎn)，但關于精子DNA損傷的機制尚無統(tǒng)一的定論。研究表明精子核蛋白組型轉換與精子DNA損傷密切相關，可能是其損傷的機制之一[15,16]，目前已成為胚胎早期流產(chǎn)原因研究的熱點。本研究通過檢測我院生殖中心64例復發(fā)性流產(chǎn)患者配偶的精子核蛋白組型轉換，分析其與精液參數(shù)、年齡、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關性。

資料和方法

一、研究對象

本研究選取2017年1月至2017年10月就診于我院生殖醫(yī)學中心門診，診斷為RSA的夫婦64對，男性年齡24～52歲。排除以下雙方流產(chǎn)因素：染色體核型(男性或女性)異常、子宮和輸卵管異常、抗磷脂綜合征、多囊卵巢綜合征、胰島素抵抗、甲狀腺功能異常、抗米勒管激素異常等。這項研究由我院生殖中心倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

二、精液分析

禁欲2-7d手淫收集精液，完全液化后，通過計算機輔助精液分析系統(tǒng) (computer-aided sperm analysis,CASA)按照 《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第五版）[17]規(guī)定進行精液常規(guī)分析，其中精子形態(tài)檢測使用Diff-Quik方法，每張玻片至少分析200條精子，并記錄形態(tài)異常的精子所占百分率。剩余精液用于精子核蛋白組型轉換與DFI檢測。

三、精子核蛋白組型轉換

使用精子核蛋白組型轉換檢測試劑盒 （苯胺藍染色法）（華康公司，深圳，中國）測定精子細胞核中組蛋白與魚精蛋白的比值。首先把5μL制備的精液涂在載玻片上并使其干燥，再將涂片在0.2mol磷酸鹽緩沖液（pH7.2）中的3%緩沖戊二醛中固定30min；然后用5%苯胺藍水溶液與4%乙酸（pH3.5）混合5min染色，陽性染色表明組蛋白與魚精蛋白轉變異常；最后在顯微鏡下評估至少400個精子細胞，并計算頭部染色精子的百分比。精子核蛋白組型轉換異常率≤30%判定為正常。

四、精子DFI檢測

使用流式細胞儀進行精子DFI的檢測，至少計數(shù)5000個以上精子且重復計數(shù)2次。利用熒光絡黃染料（吖啶橙）具有高度的核酸特異性染色的特性對精子DNA進行染色，染色后斷裂的單鏈DNA精子在激光下呈紅色熒光，而正常雙鏈DNA精子呈綠色熒光。然后采用流式細胞術收集熒光信號，再采用專用的軟件分析檢測結果。

五、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以X±SD表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；相關性分析采用Pearson法；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、精子核蛋白組型轉換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的比較

納入的64例男性患者中，精子核蛋白組型轉換正常組54例，異常組10例。核蛋白組型轉換正常組與異常組比較，精子濃度、正常形態(tài)百分率與DFI有顯著性差異，而年齡、精液量、前向運動精子百分比和流產(chǎn)次數(shù)之間無統(tǒng)計學差異（表1）。

二、精子核蛋白組型轉換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關性分析

表1 精子核蛋白組型轉換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的比較(x±s)

表2 精子核蛋白轉換與年齡、精液參數(shù)、DFI及流產(chǎn)次數(shù)的相關性分析（n=64）

圖1 精子核蛋白組型轉換與DFI的相關性分析散點圖

Pearson相關性分析顯示，精子核蛋白組型轉換異常率與精子DFI顯著正相關（圖1，表2），與年齡、精液量、精子濃度、前向運動精子百分比、正常形態(tài)百分率及流產(chǎn)次數(shù)無明顯相關性（表2）。

討 論

目前RSA病因不明，而且臨床上缺乏基于循證醫(yī)學證據(jù)的診斷和治療策略，所以復發(fā)性流產(chǎn)是生殖醫(yī)學中常見難題之一。流產(chǎn)的危險因素中，女方因素研究較多，而男性相關因素的研究較少，目前僅限于染色體核型分析和精子DNA損傷檢測。精子是一個非常復雜和特殊的細胞，在精子發(fā)生過程中，不僅染色體數(shù)目和DNA含量發(fā)生了變化，核蛋白組型也會發(fā)生規(guī)律性的轉換，即由富含賴氨酸的組蛋白逐漸轉換為富含精氨酸和胱氨酸的魚精蛋白，由于魚精蛋白的體積僅是組蛋白的一半，所以可使精子染色質結構進一步濃縮，從而使精子遺傳物質抗酸性和穩(wěn)定性進一步增強。在人精子中，組蛋白與魚精蛋白的正常轉換率約為85%，剩余15%的精子染色質仍與特定區(qū)域的組蛋白結合。如果精子核蛋白組型轉換異常，則會導致染色質的結構變得松散，螺旋化程度降低，從而容易受到活性氧和其他有害因素的影響，精子遺傳物質受到損傷，最終影響精子的受精能力，如果損傷程度超出早期胚胎的修復能力就會影響胚胎早期發(fā)育甚至導致流產(chǎn)[15,16,18-21]。另一方面，魚精蛋白還能抑制DNA轉錄及基因表達，使精子遺傳物質保持穩(wěn)定[13]。因此精子內核蛋白組型轉換是評價精子成熟度的重要指標，與精子DNA損傷關系密

切[21]。

多項研究結果表明，人類精子核蛋白組型轉換異常與精子發(fā)生障礙及DNA損傷密切相關，同時可能影響精卵結合，精子核蛋白組型轉換異常率是目前預測受精率最有意義的評價指標[22,23]。我們研究結果表明RSA患者中，精子核蛋白組型轉換異常組精子濃度、正常形態(tài)百分率明顯低于正常組，DFI則明顯高于正常組。葉飛等[24]研究認為核蛋白組型轉換異常率≤30%組精子正常形態(tài)百分率明顯高于異常率≥60%組，而DNA損傷則顯著低于后者，但與30%＜異常率＜60%組相比均無統(tǒng)計學差異，其研究結果與我們的結果不完全一致，原因可能是前者研究分成核蛋白組型轉換異常率≤30%組、30%～60%組和≥30%三組，而我們的研究只分為兩組。同時相關性分析結果顯示反復流產(chǎn)夫婦男性精子核蛋白轉換異常率與精子DFI顯著正相關。國內外多項研究也發(fā)現(xiàn)精子組蛋白轉換異常或者魚精蛋白缺乏的患者精子DFI明顯升高[14,24-29]，與我們的研究結果基本一致。多數(shù)研究使用了不同的技術進行精子核蛋白組型轉換的檢測，例如變性條件下的苯胺藍、甲苯胺藍、色霉素A3和吖啶橙等方法進行研究，無論使用何種技術，都得出了相同的結果。因此，核蛋白組型轉換異常可能是精子DNA損傷的原因之一，可進一步影響精子的受精能力及早期胚胎質量甚至導致流產(chǎn)。

綜上所述，我們研究發(fā)現(xiàn)RSA患者配偶精子中核蛋白組型轉換正常組和異常組在精子濃度、正常形態(tài)百分率以及DFI存在顯著差異，同時核蛋白組型轉換異常率與精子DFI顯著正相關，其異常可能是精子DNA損傷的原因之一，可作為臨床評估RSA男性因素的一項可靠指標。但本研究入組患者例數(shù)較少，尚需要擴大樣本量來進行深入研究。