精子DNA碎片指數對精子冷凍復蘇率的影響*

胡 燁 范宇平 黃文強 王 羽 潘家坪 楊 昊 滕曉明

同濟大學附屬第一婦嬰保健院生殖醫學中心（上海 200040）

精子DNA碎片指數 （DNA fragmentation index,DFI）近年在全國范圍已逐漸成為常規項目，多數研究和文獻提示DFI對男性生殖，包括輔助生殖技術存在影響，即使是特發性的男性生育力低下[1-2]。然而也有爭議，至少目前尚未形成DFI具體影響輔助生殖過程機制的定論。精子冷凍的過程對精子本身的染色質和頂體完整性存在影響[3]，但是在輔助生殖技術當中，精子冷凍保存至今仍是不可缺少的重要內容之一。本研究擬探索精子冷凍前精子DFI水平是否對精子冷凍復蘇存在影響。

材料與方法

一、一般資料

2017年在上海市第一婦嬰保健院生殖中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）的所有患者在術前行自精精子冷凍保存的共55例，排除因嚴重少弱精子癥和隱匿精子癥凍精的患者，實際入組患者36例，按DFI≥27%和DFI＜27%分為兩組。

二、精液標本的采集和處理

所有研究對象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按標準步驟留取精液標本。受檢者取精流程如下：排尿；用肥皂清洗雙手和陰莖，減少來自皮膚共棲微生物所致的標本污染的風險；沖洗掉肥皂沫；使用一次性新的毛巾擦干手和陰莖；精液射入無菌容器。精液標本取出后立即放置于37℃溫箱內，待精液充分液化后進行鏡下分析。

三、精子DFI檢測

精子DNA完整性檢測采用浙江星博生物科技有限公司精子核完整性染色試劑盒（浙江星博生物科技有限公司，產品標準編號：YZB/浙（甬）0159-2-12）。 嚴格按照說明書的步驟進行標本制備操作。用流式細胞儀檢測樣本，檢測時需在平衡樣品線后，將已染好色的樣本加入樣品室，立即啟動樣品流，檢測精子的流動速度（流動速度應在100～300個/s，若速度過大，應重新稀釋樣本）；2 min后開始收集數據，至少有5 000個細胞的測定值加以記錄和統計，每個樣本至少連續檢測2次。精子核經酸處理液處理后，經吖啶橙染色，異常精子核染色質成單鏈與染料吖啶橙結合發橙黃色或紅色熒光；正常精子核染色質為雙鏈，與吖啶橙結合發綠色熒光，若紅光比值增高，說明精子核完整性程度降低。

四、精子冷凍

精液取出后，37℃溫箱內液化。將冷凍保護劑取出，平衡至室溫。精液液化后進行常規檢查，包括精液量、顏色、氣味、pH、液化情況、精子濃度、活力及細胞等情況。準備精液冷凍管，將患者姓名、病歷號和冷凍日期等做好記錄。根據精液的量，按照1：1的比例緩慢加入冷凍保護劑，邊加入邊搖晃混勻。充分混勻精液與冷凍保護劑，室溫放置15min。將精液冷凍保存管固定在鋁架上，懸于液氮平面上方15cm處，進行熏蒸，液氮盒加蓋放置15min后，將冷凍管投入液氮，保存在液氮罐相應位置。

五、統計學方法

檢測結果用SPSS16.0進行統計分析。數據以均數±標準差（±s）表示。計量資料采用兩均數t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，組間比較P＜0.05提示差異具有統計學意義。

結 果

入組精子冷凍患者共36例，年齡 39.50±7.29（28～59）歲，不育年限 2.92±1.30（1～8）年。 分為 DFI≥27%組11例，DFI＜27%組25例。比較兩組患者年齡、不育年限及術前精子正常形態率，結果顯示差異無統計學意義（P=0.29，P=0.77，P=0.28），見表 1。

表1 基本情況比較（±s）

表1 基本情況比較（±s）

年齡（歲） 不育年限（年） 精子正常形態率（%）DFI＜27%組 38.48±6.19 2.96±1.49 2.76±1.59 DFI≥27%組 41.82±9.26 2.88±0.75 2.27±1.01 P 0.29 0.77 0.28

DFI≥27%和DFI＜27%的精子冷凍前后的濃度變化、活力變化及前向運動（PR）精子總數變化的差異均無統計學意義（P=0.07；P=0.76；P=0.58），見表 2。

以冷凍復蘇率60%為分組標準，DFI≥27%組冷凍復蘇率≥60%的患者4例；DFI＜27%組冷凍復蘇率≥60%的患者12例，比較兩組冷凍復蘇率差異無統計學意義（P=0.52），見表 3。

表2 兩組冷凍前后濃度、活力和PR精子總數比較

表3 不同DFI水平精子冷凍后復蘇率分析n（%）

討 論

精子DNA完整性的檢測早在1993年就已被提出，由于費用、檢測方法的可行性和標準不一致等問題，直到近年，DFI才作為男性精子功能的重要參數在臨床廣泛開展[4]。但是DFI的檢測手段、治療方法以及臨床指導意義都存在不少爭議。

DFI的參考值根據檢測方法的不同而各有不同，本研究中DFI的檢測均通過流式細胞術精子染色質檢測（sperm chromatin structure assay，SCSA），按臨床報告標準：DFI≤15%表示DNA完整性好；DF I15%～30%表示DNA完整性一般；DFI≥30%表示DNA完整性差。本研究以27%作為分組標準主要是參考了DFI檢測方法相同的近期文獻[3]。然而DFI結果是27%還是30%并不是直接表示剩余的精子是正常的，有文獻指出剩余部分的精子已可能存在染色質完整性異常，只是檢測方法未能發現[5]。基于精子細胞的獨特結構，要研究其DNA損傷的機制比體細胞DNA損傷復雜，精子DNA在精子發生的生理過程中經歷多次變化。而DFI的檢測目前能提供的是一些DNA損傷在生殖過程中產生影響的前因后果的重要信息[6]，故DFI參考值的界定在不同中心可能會有所不同，需要結合臨床信息作判斷。

在細胞冷凍過程中，冷凍損傷的發生是不可避免的，引起細胞冷凍損傷的主要因素為細胞滲透壓改變以及溫差驟變導致細胞內冰晶形成，從而造成細胞和細胞膜結構損傷，而在復蘇過程中，復溫速率也可能對細胞存活率形成影響[7]。既往認為DNA損傷的精子對低溫的耐受能力下降，可能的機制是：精子DNA損傷嚴重的精液中活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）水平也增高，從而降低了精子對冷凍過程的耐受能力[8]，另外DNA損傷可能隨精子凋亡過程出現，精子DFI高相對精子凋亡率也增加[9]，而凋亡精子可能對低溫的耐受性差。

本研究結果顯示DFI≥27%和DFI＜27%的精子冷凍前后的濃度變化、活力變化及前向運動精子總數變化的差異均無統計學意義（P=0.07；P=0.76；P=0.58），比較兩組冷凍復蘇率也無統計學差異 （P=0.52）。該結果提示，精子冷凍前DFI水平對于精子冷凍過程沒有明確影響；或者說，精子DFI水平高于正常并不是冷凍保存精子的禁忌證，并不是建議不處理DFI高的患者。DFI的影響較少在受精和受精卵過程表現出來，通常更多在胚胎3～5d或移植窗口期之后表現[10-12]。DFI對精子冷凍前后精液常規參數及冷凍復蘇率不存在影響也與這一結論相符。

本研究結果發現精子冷凍前DFI水平對于精子冷凍后參數變化和復蘇率沒有影響，也明確高DFI并不能作為精子冷凍的禁忌證。當然結合ROS等氧化應激指標、采用不同的DNA完整性檢測方式以及多中心、更大樣本的臨床數據分析可能是進一步研究的方向。