基于1H-NMR的復合應激勃起功能障礙大鼠模型血清代謝組學及藥物干預的研究*

艾孜孜·熱合曼 劉鳳霞 斯依提·阿木提 劉文娟 阿地力江·伊明**

1.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物學教研室（烏魯木齊，830011）2.新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖教研室（烏魯木齊，830011）

勃起功能障礙（erectile dysfunction，ED）是指持續(xù)或反復不能達到或維持足夠的陰莖勃起完成滿意的性生活，40～70歲之間的男性中，約52%患有不同程度的ED[1]，而我國男性ED的總患病率為26.1%，40歲以上男性的患病率為40.2%[2]。據WHO估計到2025年ED患者將達到3.2億，并且ED的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[3]。目前ED主要的治療方法，包括5型磷酸二酯酶抑制劑、海綿體內藥物注射和真空裝置等[4]，但整體效果欠佳[5]，因此ED確切的發(fā)病機制和更有效的治療方案亟待解決。ED作為男性常見性功能障礙疾病，他不僅以心血管疾病、糖尿病、高脂血癥等重大疾病的伴發(fā)性疾病出現，同時也可以以ED這一獨立疾病形式出現。目前針對前者研究較為深入，但是從環(huán)境因素出發(fā)，研究環(huán)境溫度改變、環(huán)境植物雌激素對勃起功能的影響尚有不足，有待深入開展。故在前期工作中，我們通過模擬冷環(huán)境與雌激素樣飲食的復合刺激條件建立了復合應激大鼠模型，對其性功能改變與勃起功能損傷進行了初步的研究，并成功篩選出了ED大鼠模型[6,7]。本研究，則在此基礎上，進一步通過核磁共振（1H nuclear magnetic resonance，1HNMR）技術檢測了復合應激ED大鼠模型血清代謝組變化和伊木薩克片的影響，探討ED可能的機制與伊木薩克片的調控作用，現報道如下。

資料與方法

一、資料

（一）實驗動物

選取正常雄性Sprag-Dawley（SD）大鼠150只，SPF級，6 周齡，體質量（200±10）g，性成熟雌性大鼠 20 只，2月齡，用于阿樸嗎啡（apomorphine，APO）陰莖勃起實驗和交配實驗，均由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供。實驗動物適應性常規(guī)飼養(yǎng)1周，室溫（20±2）℃，濕度40%～60%，自由飲水進食。

（二）主要實驗儀器

600 MHz核磁共振波譜儀 （美國Varian公司），－80℃超低溫冰箱（中國海爾公司），-20℃低溫冰箱（中國海爾公司），Millipore水純化系統(tǒng) （美國 Millipore公司），低溫臺式超速離心機 （德國Eppendorf公司），BSA224S-CW型電子分析天平 （北京賽多利斯天平有限公司）。

（三）主要試劑和藥材

阿樸嗎啡 （批號：A4393-250MG，美國Sigma公司）；黃體酮（批號：120804，浙江仙琚制藥股份有限公司，）；雌二醇（批號B130613，寧波市三生藥業(yè)有限公司）；伊木薩克片（批號：20130501，規(guī)格：6 片×1 板 /盒，新疆和田維吾爾藥業(yè)有限責任公司）；重水 （批號：20170605，美國 Cambridge isotop laboratories公司）；WG-1000-7型核磁管 （規(guī)格：5mm×177.8mm，美國Wilmadlabglass公司）；4，4-二甲基 -4-硅戊烷 -1-磺酸（DSS）、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、戊巴比妥納、酒精、氯化鈉、甲醛、無水乙醇均為國產分析純試劑（購自北京中杉金橋生物技術有限公司）。

二、方法

（一）復合應激ED大鼠模型的制備、分組及伊木薩克干預

150只正常雄性大鼠中，隨機抽取30只為正常對照組（N組），余120只為造模組，按照文獻[5,6]方法制備環(huán)境雌激素樣飼料、發(fā)情雌鼠和復合應激ED大鼠模型，篩選ED大鼠模型后，隨機分為復合應激ED大鼠模型組 （ED組，30只）和伊木薩克干預組 （Y組，30只）。Y組大鼠予以伊木薩克片每日灌胃1次（250mg/kg體質量），其余2組使用等劑量蒸餾水灌胃，干預2周。定期檢測APO勃起功能和交配能力。

（二）血清樣本采集

藥物干預結束后，將所有大鼠稱量，并用1%戊巴比妥鈉腹腔注射 （40 mg/kg）麻醉。腹主動脈抽血20 mL，室溫靜置 2 h，3000×g離心10 min，分離血清，置-80℃冰箱保存。

（三）血清樣品預處理

N組、ED組和Y組大鼠血清樣品從低溫冰箱中取出并在室溫中解凍，每份取700μL，加入3KDa超濾管內，12000×g離心15 min，取上清液450μL加到5 mm的核磁管內，再加重水配制的DSS緩沖溶液50μL（濃度為5.17 mmol/L)、混勻。

（四）大鼠血清1H-NMR測定及數據處理

將N組、ED組和Y組大鼠血清核磁管置于600 MHz核磁共振波譜儀，進行1H-NMR檢測。預飽和方式抑制水峰，脈沖序列為NOESYPR1D（RD-90-t1-90-tm-90-Acq）。測試溫度25℃，飽和時間為2 s，單次掃描時間為1.636 s，譜寬10000 Hz，采樣點數64 k，掃描次數為128次。使用MestRenova分析軟件 （Mestrelab Research，Santiagode Compostella，西班牙）將核磁信號進行轉換。以重水化學位移0.00 ppm單峰質子信號作為化學位移參考峰定標調整基線，得到一維氫譜圖。將1H-NMR圖譜在化學位移 δ9.0～0.5 ppm范圍內以δ0.003 ppm積分區(qū)間進行分段積分，除去δ5.20～4.75 ppm之間的水峰積分值。導入SIMCA-P＋11統(tǒng)計軟件（瑞典Umetries公司）進行偏最小二乘判別式法分析（partial least squares diseriminant analysis，PLS-DA）篩選3組之間的差異性代謝物；進行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA）得出每2組之間的差異性代謝物。參數R2X、R2Y表示OPLS-DA模型的擬合情況，Q2表示模型的可預測度，他們的大小直接反應模型的可靠程度，其值越接近1，代表模型擬合度越好，Q2＞0.4，則模型可靠。代謝物含量變化情況采用OPLS-DA分析中的變量相關系數r判斷，r為負值，說明代謝物在實驗組血清內的含量高于對照組，r為正值，表示血清代謝物在實驗組的含量低于對照組，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、大鼠1H-NMR血清代謝物圖譜指認

采用MestRenova分析軟件對N組、ED組和Y組大鼠血清1HNMR圖譜中主要代謝物成分信號進行了歸屬，指認出的主要代謝物成分有21個（圖1），其化學移位、譜峰歸屬等詳細信息見表1。

二、大鼠血清代謝物OPLS-DA模型擬合度分析

將1H-NMR圖譜以OPLS-DA和PLS-DA方法進行模式識別分析，可得到3組大鼠血清代謝物1H-NMR圖譜的二維散點圖和三維空間分布圖，圖中每一個點代表1個變量。3組大鼠血清代謝物在分布圖中分別落在不同區(qū)域，說明這些分散點中所包含的信息必定存在不同程度的差異。3組大鼠血清代謝物分布圖（圖2），R2X、R2Y 和 Q2分別為 0.627、0.482、0.41。 N 組和 ED 組大鼠血清代謝物分布圖，R2X=0.45、R2Y=0.652、Q2=0.596（圖3）。Y組和ED組大鼠血清代謝物分布圖，R2X=0.524、R2Y=0.609、Q2=0.485（圖 4）。 結果說明模型擬合度好，可靠程度高。

圖2 三組大鼠血清代謝物PLS-DA 分析

圖3 N組和ED組大鼠血清代謝物OPLS-DA分析

圖4 ED組和Y組大鼠血清代謝物OPLS-DA分析

三、各組大鼠血清差異性代謝物分析

與N組比較，ED組大鼠血清中VLDL、亮氨酸、膽堿、谷氨酰胺、丙酮、纈氨酸、γ-氨基丁酸、丙酮酸、谷氨酸、檸檬酸、肌酸、牛磺酸、蛋氨酸、天冬氨酸表達量降低；乳酸、丙氨酸、乙酰乙酸、氧化三甲基胺、β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖表達量升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與ED組比較，Y組大鼠血清中乳酸、丙氨酸、氧化三甲基胺，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖等表達量顯著降低；VLDL和膽堿表達量顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其化學移位、譜峰歸屬等詳細信息見表1。

表1 各組大鼠血清差異性代謝物

討 論

應激是機體在各種內外環(huán)境因素刺激時所出現的全身性非特異性適應反應，又稱為應激反應，它與糖尿病、高血壓、高脂血癥和肥胖癥等代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[8]。越來越多的研究發(fā)現各種不同應激可誘導體內代謝水平發(fā)生改變，進而導致ED[9,10]。本團隊前期研究采用環(huán)境雌激素樣飲食聯(lián)合冷刺激的干預方法成功建立了復合性應激ED大鼠模型，伊木薩克可顯著改善ED大鼠的勃起功能[6]。本研究通過1HNMR檢測此ED大鼠模型血清代謝組的變化，探討其發(fā)病機制，并觀察伊木薩克干預后對代謝組的影響。

本研究結果發(fā)現亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和檸檬酸含量發(fā)生顯著改變。亮氨酸和丙氨酸與蛋白質代謝相關，能減輕大鼠機體的消耗，改善缺氧狀態(tài)；亮氨酸含量異常還可引發(fā)血管氧化應激，加重動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[11,12]。谷氨酰胺是體內重要抗氧化劑牛磺酸的前體，維持組織中谷胱甘肽的儲備、保護細胞、組織和器官免受自由基損傷，減輕應激反應，提高機體抗氧化能力[13]，參與動脈粥樣硬化發(fā)展[14,15]。纈氨酸可抑制腫瘤壞死因子、血管黏附因子-1、超氧化因子-2和內皮型一氧化氮合酶等誘導的內皮功能紊亂[16,17]；其衍生物L-谷氨酸-纈氨酸抑制炎細胞因子和白介素-1、6、8的表達，并通過抑制上皮細胞中腫瘤壞死因子-α信號傳導通路減輕炎癥[18]，而炎癥和內皮功能紊亂也是ED的重要誘因[19,20]。谷氨酸是一種興奮性氨基酸，在炎癥反應中有重要作用。當組織損傷時，影響到谷氨酸代謝，激活一系列興奮性氨基酸受體，誘導炎癥介質的釋放，導致炎癥[21,22]；谷氨酸還可誘導神經型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子-α、干擾素-Y、白介素-1β、一氧化氮和活性氧等引起氧化應激反應和血管內皮功能紊亂等[23,24]；而炎癥、氧化應激反應和血管內皮損傷是ED常見的誘因[25,26]。γ-氨基丁酸可以通過拮抗谷氨酸的興奮性毒性，減輕細胞損傷和凋亡[27]，還能減少耗氧量，而機體的缺氧狀態(tài)與ED有著密切的關系[12,28]。蛋氨酸是琥珀酰輔酶A、同型半胱氨酸、半胱氨酸、肌酸和肉堿的前體，也是人體內最容易被氧化的必需氨基酸之一。蛋氨酸缺乏可導致心臟血管病變、睪丸病變等；還可通過調節(jié)谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化指標抑制氧化應激、抑制促炎細胞因子和核因子-κB活化來減少炎癥[24,29]。檸檬酸、谷氨酸和谷氨酰胺都是三羧酸循環(huán)的中間代謝物，參與炎癥代謝通路，與動脈粥樣硬化有密切的相關性[30,31]。檸檬酸還具有降低內毒素引起的氧化應激的作用[14,32]。天冬氨酸含量變化與細胞凋亡、生長、分化炎癥反應相關[33,34]。在細胞發(fā)生骨架破壞、缺氧或ATP耗竭時，引起氧化應激，進而導致細胞凋亡[35]，參與高血壓、心肌細胞凋亡和動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[12,36]。結果提示，ED組大鼠血清中亮氨酸、谷氨酰胺、牛磺酸、纈氨酸、谷氨酸、γ-氨基丁酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和檸檬酸含量改變可能是機體物質代謝紊亂的結果，通過參與氧化應激、炎癥反應，進一步誘導內皮功能障礙和血管性病變，進而導致ED發(fā)生發(fā)展。

β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸均參與機體能量代謝和物質代謝。葡萄糖可無氧酵解生成乳酸并產生少量的三磷酸腺苷供給機體能量[37]。葡萄糖含量異常可造成線粒體功能紊亂，影響機體正常物質和能量代謝，導致細胞凋亡，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[38]；血糖濃度增高還可以抑制血管舒張、導致血管壁鈣化和功能障礙，而這些變化是ED的重要誘因[39,40]。呋喃糖含量增多，導致活性氧物質的產量增加，導致膜脂質過氧化，細胞結構損傷和凋亡[41]。呋喃糖還可通過毒性作用，導致促炎細胞因子的增多，參與炎癥反應和內皮功能紊亂[42,43]，而炎癥反應和內皮功能紊亂為ED的重要誘因[19,20]。乳酸能減輕機體的消耗，改善缺氧狀態(tài)[11,12]。缺氧可使海綿體平滑肌細胞收縮表型減少和海綿體纖顫等海綿體微結構改變，進而引起ED[44]。乳酸還可影響血管的收縮、舒張，而陰莖血管的正常收縮、舒張是陰莖正常勃起的關鍵[45,46]。胍基乙酸在酶的催化作用下能夠合成肌酸，肌酸被認為是一種能量緩沖劑[47]，能影響血漿二氧化碳含量，參與高碳酸血癥，與陰莖海綿體組織損傷有關，肌酸還參與細胞凋亡和氧化應激，這些功能都與ED密切相關[48,49]。胍基乙酸還可生成超氧陰離子（氧自由基），產生活性氧，而超氧陰離子等氧化應激因子在ED中發(fā)揮著重要的作用[47,50]。我們的研究發(fā)現，復合應激ED大鼠血清中β-葡萄糖、β-呋喃糖、乳酸、胍基乙酸、肌酸含量顯著變化，此變化涉及的能量和物質代謝紊亂可能通過誘導炎癥、細胞凋亡、脂質過氧化和氧化應激反應，引起內皮功能障礙、血管舒張功能降低、海綿體微結構改變等導致ED。

本研究結果還發(fā)現，與血脂的運輸和代謝密切相關的極低密度脂蛋白（VLDL）、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、氧化三甲基銨（TMAO）和膽堿在復合應激ED大鼠血清中含量顯著改變。VLDL堆積引起脂代謝紊亂可導致動脈粥樣硬化、斑塊形成和血管內皮功能障礙等[51,52]。而且VLDL與細胞增殖、細胞凋亡、炎癥反應、血管內皮功能紊亂有關[19,20]。丙酮和乙酰乙酸均為酮體的組成部分。脂肪利用增加時，血中乙酰乙酸和丙酮等酮體濃度就會升高[53]，能誘導氧化應激，其中乙酰乙酸影響VLDL的含量，而氧化應激和VLDL代謝紊亂都能引起陰莖血管病變，進而參與ED的發(fā)生發(fā)展[25,26]。丙酮酸在糖、脂肪和氨基酸間作為樞紐互相轉化，通過阻止超氧化物的形成防止氧自由基的產生，還可以與過氧化氫反應生成二氧化碳和水清除氧自由基，因此具有防止氧化損傷的作用[14,54]；丙酮酸還以丙酮酸鹽的形式抑制腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6等炎癥因子的釋放，穩(wěn)定血管內皮細胞，減少細胞凋亡，進而起到保護內皮細胞的作用，而氧化應激和內皮功能紊亂已證實是ED發(fā)病的重要機制[55,56]。TMAO是由富含膽堿、磷脂酰膽堿和左旋肉堿的食物經腸道微生物轉化生成三甲胺，在肝酶和黃素單加氧酶的作用下生成，參與氧化反應、脂質代謝和炎癥反應，增加患心血管疾病的風險[57,58]。膽堿是細胞膜結構及信號轉導的重要成分，膽堿抗炎通路興奮后可抑制促炎因子的產生和釋放[59,60]。本研究結果提示VLDL、丙酮、乙酰乙酸、丙酮酸、TMAO和膽堿含量顯著改變，可能與能量和脂代謝紊亂通過誘導炎癥、氧化應激和內皮功能障礙導致ED發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究采用1H-NMR檢測復合應激ED大鼠模型血清代謝組變化，并觀察伊木薩克片的干預效果。結果發(fā)現21種代謝物在復合應激ED大鼠模型血清中發(fā)生顯著變化，其中14種代謝物含量下降，7種代謝物含量增高；經過伊木薩克片干預后，6種代謝物含量降低（乳酸、丙氨酸、氧化三甲基銨，β-葡萄糖、胍基乙酸、β-呋喃糖），2種代謝物（VLDL和膽堿）含量增高。此結果提示，復合應激ED大鼠模型出現能量和三大物質代謝紊亂，而伊木薩克片干預后可能通過改善機體代謝紊亂，進而抑制氧化應激反應和炎癥反應引起的內皮功能障礙和血管病變等機制促進ED的恢復，但其具體的機制，尚需進一步研究。