Syn61：合成生物學的里程碑

編譯 張茜

迄今為止，最大的人工合成基因組已經完成，其氨基酸編碼密碼子的數量比通常要少。這提高了編碼含有非自然氨基酸殘基的蛋白質的可能性。

圖1 大腸桿菌的通用圖片，研究人員重新設計了該生物的遺傳密碼

在過去的10年中，化學合成DNA成本的降低和DNA片段組裝方法的改進使得科研人員能夠將合成生物學的規模擴大到產生整個染色體和基因組的水平。之前，合成DNA已經構建了多達100萬堿基對，尤其是一組來自釀酒酵母的染色體和支原體分枝桿菌的多個版本的基因組。現在，朱利葉斯·福萊頓斯（Julius Fredens）等人在《自然》雜志上發表文章，報道了一個有著400萬堿基對的大腸桿菌基因組合成版本的完成。劍橋大學分子生物學家賈森·秦（Jason Chin）是這篇論文的通信作者。這是合成基因組學新興領域的一個里程碑，并最終將該技術應用于實驗室的主力細菌。

合成基因組學為理解生命規律提供了一種新方法，同時也將合成生物學推向了一個可以編寫基因組進行設計的未來。該領域的先驅——馬里蘭州羅克維爾市克雷格·文特爾研究所的科研人員——已經使用這種方法更好地定義了獨立生存的細胞所需的最小基因集。通過采用計算機重新設計基因組片段、化學合成片段并進行組裝的方法，先驅者們成功地將分枝桿菌基因組的大小縮減了大約50%。根據以往對大腸桿菌的研究表明，僅僅使用基因組編輯工具進行同樣的操作將會更加費力：基因刪除法最多只能刪除基因組的15%。

福萊頓斯和他的同事們利用大腸桿菌的這種簡化版基因組作為合成基因組的模板，同時也考慮了另一種最小化——密碼子簡化。遺傳密碼存在固有的冗余：共有64個密碼子（3個一組的“字母”或堿基），卻只能編碼20個氨基酸，再加上標記蛋白質編碼序列開始和結束的起始密碼子和終止密碼子。這種冗余意味著，例如，有6個編碼絲氨酸的密碼子，以及3個可能的終止密碼子。通過設計、合成和組裝，福萊頓斯等人能夠在其編碼蛋白質的序列中只使用64個密碼子中的61個，來構造一個大腸桿菌基因組。他們用同義密碼子（“拼寫”不同，但是能給出相同翻譯指令的密碼子）替換掉了兩個絲氨酸密碼子和一個終止密碼子。過去的工作中使用了基因組編輯工具已經產生了一種合成大腸桿菌，它只使用64個密碼子中的63個，但這只需要將序列為TAG的終止密碼子（基因組中只含有321個這種終止密碼子）換成另一種終止密碼子。減少到61個密碼子則需要對多達18 214個密碼子進行改變，這就必須用到基因組合成方法。

福萊頓斯和他的同事們利用大規模DNA組裝和基因組整合的方法構建了他們的合成大腸桿菌基因組。他們先前已經利用這些方法對大腸桿菌中密碼子更改極限進行了探索。在他們的方法中，DNA被計算機設計，化學合成并組裝成大小為100千堿基的片段，并在釀酒酵母中將其裝入載體；然后，這些載體被轉入大腸桿菌中，并直接整合入基因組對應的自然區域中。將這一過程重復5次，結果就是DNA中的500千堿基片段被合成版本所取代。他們用這種方法生產了8株大腸桿菌，每一株都攜帶有合成的DNA片段，涵蓋基因組的不同區域。然后用接合法將這些片段接合起來，形成完整的合成基因組。

這次大規模構建極其成功，脫靶突變率非常低，但也并非沒有挑戰性。大腸桿菌基因組中的許多基因與其他基因均有部分重疊，在91例重疊區域中均包含需要進行改變的密碼子。這很復雜，因為一個蛋白質編碼序列的同義變化有可能會引起重疊序列編碼的氨基酸的改變。為了解決這個問題，研究小組“重構”了基因組中的79個位點，復制序列，將重疊的編碼序列分離成單獨的編碼序列（圖2）。

最終的菌株被證明可以存活，并能夠在一系列典型的實驗室條件下生長，盡管與野生型相比活力略弱。它不再使用終止密碼子TAG和兩個絲氨酸密碼子TCG和TCA，因此識別這些密碼子的細胞裝置現在就可以被刪除或重新分配，用以募集大多數活細胞通常使用的20種氨基酸以外的“非典型”氨基酸。這種招募在63密碼子型的大腸桿菌中已被證明是有用的，從生物技術項目角度來看，非典型氨基酸被編碼到所需的序列位置，以提供能夠參與自然蛋白質所不能參與的化學反應的殘基；從生物安全角度來看，可讀的DNA編碼信息在合成大腸桿菌內和外的自然傳輸是有限的，因為細胞的遺傳密碼的運作方式與自然界其他生命體略有不同。預計所有這些用途都將在新的61密碼子型大腸桿菌中得到擴展，該大腸桿菌有潛力編碼使用多個非典型氨基酸，并生成一個更為嚴格的基因防火墻（因為64個密碼子中有3個不再被識別）。

合成一個擁有400萬堿基對的基因組，并將遺傳密碼減少到61個密碼子，這是合成基因組學的新紀錄，但這個新紀錄可能不會維持太久。國際Sc2.0聯盟即將合成全部16個染色體共1 200萬堿基對的釀酒酵母基因組——真核生物首個合成基因組，真核生物包括植物、動物和真菌——57密碼子型大腸桿菌基因組的合成工作也正在進行中。此外，科學家們還在構建一種比野生型少兩個密碼子的鼠傷寒沙門氏菌基因組。未來，這可能會使攜帶合成基因組的細菌能夠作為基于細胞的技術應用于人類腸道。

圖2 重編碼基因組的設計和構建

從技術的角度來看，所有這些不同的項目的最有趣的方面是合成基因組的工作流結構非常相似——千堿基的合成DNA片段在酵母細胞中（通過同源重組的過程）被組裝成50到100千堿基的碎片，之后（通過可選擇的重組方法）這些碎片被用來取代靶標生物體內的自然序列。方法標準化將使步驟自動化，更多的研究小組將會進入該領域。基因組最小化和密碼子簡化只是這項新技術的第一個用途，終有一天這項新技術將會幫助我們構建出功能重組的基因組和被設計用來指導細胞執行特定任務的個性化定制基因組。