碳源和微生物協(xié)同負載體系建構的研究

張燕妮，祝余輝，楊 柳，任迎港，張媛媛，伊佳偉，夏遠乾，方曉軍，孫 燕

（杭州師范大學錢江學院，浙江 杭州 310036）

0 前言

微生物固定化技術研究進展。微生物固定化技術是生物工程領域的一項新興技術，是用化學的或者物理的手段和方法將游離細胞或酶定位在某一特定空間范圍內(nèi)，以提高其濃度，使其保持較高的生物活性并反復利用的方法[1]。已報道的菌劑包埋載體材料包括天然材料棉纖維[2]、改性的竹炭材料、復合聚氨酯泡沫、經(jīng)處理的聚乙烯醇材料[3]。2015年，王青松等采用多種載體材料:海藻酸鈉、聚乙烯醇、硅藻土、竹炭粉等混合制得一種性能良好的凈水菌膠囊[4]。

國內(nèi)外關于碳源緩釋技術在污水處理中的研究。我國河道污染水體碳氮比（C/N）水平普遍較低[5]，在較多數(shù)情況下，需要投加外來碳源提高污染水體的脫氮效率。通常水體生物脫氮常用的碳源補充形式以甲醇[6]、乙醇[7]、乙酸[8]、葡萄糖、蔗糖等為主。其中甲醇、乙醇和乙酸等液態(tài)且具有一定毒性或易燃的碳源在運輸及使用上存在一定風險[9]；投加方式多采用直投，使用中容易產(chǎn)生分布不均、局部過量等問題，從而導致污水處理效果不理想或造成二次污染。近年來，學者們開始研究和尋找一些新型的固態(tài)緩釋碳源。

本研究將系統(tǒng)開展固體碳源醋酸鈉負載及緩釋技術研究，并結合高效降解污染物的菌劑（市售芽孢桿菌）固定化技術，構建微生物固定化/碳源緩釋協(xié)同作用的新型污染河道生物強化處理技術。

1 實驗部分

1.1 實驗藥品和儀器

乙基纖維素（CE），國藥集團化學試劑有限公司；醋酸鈉，國藥集團化學試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉，上海強順化學試劑有限公司；丙酮，衢州巨化試劑有限公司；竹炭，浙江常青化學試劑有限公司。

臺式離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；差示掃描量熱儀（DSC），美國TA儀器有限公司；傅里葉紅外光譜儀，浙江精科計量儀器有限公司；紫外分光光度計，上海精密儀器有限公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 微球粒子的制備

（1）取適量的乙基纖維素溶于丙酮溶液中，并隨后加入醋酸鈉粉末，在30℃水浴中，在250 r/min 磁力攪拌 20 min，攪拌后，配制成 1．5～4．5 mg/mL的醋酸鈉溶液。

（2）在第一步的基礎上，往溶液中加入0．5%的十二烷基硫酸鈉100 mL，并保持30℃的水浴環(huán)境，繼續(xù)攪拌直到溶液冷卻到室溫。

（3）將已經(jīng)冷卻好的溶液進行過濾處理，得到微囊并用水洗滌后在室溫下干燥得到微球型聚合物。

（4）取不同重量的乙基纖維素和丙酮溶液按照預定的比例配比，在一定條件下磁力攪拌待混合均勻后，將含有0．5%的SDS溶液慢慢地滴入到混合的溶液中去，并控制滴加的速度保持穩(wěn)定且中速，加入完成后繼續(xù)磁力攪拌一直到溶液冷卻至室溫為止，記錄實驗比例，將冷卻后的溶液進行過濾，得到微球粒子并在室溫下干燥。

（5）將乙基纖維素配成一定濃度，按照50 g/100 mL的比例加入竹炭粉，按照5 g/100 mL的比例加入菌粉，混合均勻后加工成型，并在35℃下烘干過夜。

1．2．2 微球粒子中醋酸鈉包封率的測定

包封率的計算公式為:

包封率（%）=X包/X總×100%

X包—經(jīng)過濾處理后上清液中醋酸鈉的量

X總—加入的樣品量

記Lp(0,T;Hk(Ω))={u(x,t)|u(·)∈Hk(Ω),a.e t∈[0,T]}，其范數(shù)定義為

1．2．3 醋酸鈉的釋放率測定

準確稱取一定量的微球粒子放入蒸餾水中制成水溶液，然后設置不同的時間間隔，用滴定法分別測出其中的醋酸鈉的含量，以此來計算出試樣的釋放率。

釋放率的計算公式為:

釋放率 （%）=Y放/Y總*100%

Y放—微球粒子水溶液中醋酸鈉的量

Y總—加入的品量

1．2．4 平板法測菌落分析

（1）稱量出5 g的用研缽研磨，放入裝有100 mL稀釋液的無菌均質(zhì)杯中，機械搖勻，再用無菌吸管再一次進行稀釋操作得到試樣。

（2）用細菌管吸取適量的試樣放入9 cm培養(yǎng)皿中并加入平板計數(shù)瓊脂充分混合，在30℃下培養(yǎng)。

（3）培養(yǎng)12 h后，用肉眼觀察菌落數(shù)并記錄實驗結果。

2 結果與討論

2.1 碳源/微生物緩釋材料的外觀

由圖1可知:A為制備過濾干燥處理后的微球粒子呈白色細粉末狀。B為將A的微球加入適量的有機物經(jīng)過一定的溫度處理后可以得到光滑的粒狀的結構。C為竹炭和纖維素在加入菌粉的微球在一定條件的處理下可制成空隙較大、空隙分布較均勻的2×5 cm大小的橢球體。

圖1 碳源/微生物緩釋材料的外觀（A為醋酸鈉纖維素微球，B為有機高分子包裹的負載醋酸鈉的乙基纖維素微球，C為加入菌粉和醋酸鈉的竹碳和醋酸纖維素復合材料微球圖）Fig．1 Appearance of carbon source/microorganism sustained-release material（A is sodium acetate cellulose microsphere，B is organic polymer-coated ethyl cellulose microsphere loaded with sodium acetate，Cis bamboo carbon powder and cellulose acetate composite microsphere added with bacterial powder and sodium acetate）

2.2 負載微球粒子的包埋率分析

由表1可知，隨著乙基纖維素和醋酸鈉的質(zhì)量比增加的時候，包封率是增加的，在兩者質(zhì)量比為1∶1的時候，包埋率達到最高，為24.16%。

表1 負載微球粒子的包埋率表Tab.1 The embedding rate table for loaded microsphere particlesacetate

2.3 醋酸鈉的釋放率分析

圖2 負載醋酸鈉微球的釋放率隨時間的變化曲線圖Fig.2 The curve of the release rate of sodium acetate loaded microspheres over time

圖2 所示是表1中包封率最大的微球在不同的時間間隔下所測的醋酸鈉釋放曲線。通過比較可以看出累積釋放率持續(xù)增加，呈勻速釋放狀態(tài)，并且到釋放1天后，累積釋放率只有12%，達到了較好的緩釋效果。

2.4 竹炭微球的菌落分析

圖3所示是負載醋酸鈉和菌粉的復合微球的細菌培養(yǎng)照片。其中，圖3-A是起始的培養(yǎng)基照片，圖3-B是培養(yǎng)12 h后的培養(yǎng)基照片。圖3-B說明經(jīng)過一定時間的培養(yǎng)后出現(xiàn)了明顯的菌落，這說明包埋進去的細菌能夠依然存活著并且正常繁殖了，說明包埋成功了。

圖3 菌落培養(yǎng)實驗圖Fig.3 The experimental diagram of colony culture

2.5 差示掃描量熱分析（DSC）

圖4差示掃描量熱圖（A:碳源負載乙基纖維素；B:乙基纖維素）Fig.4 The differential scanning calorimetry（A:carbon source loaded ethyl cellulose； B:ethyl cellulose）

圖4 是乙基纖維素（B）和負載醋酸鈉的乙基纖維素（A）的示差掃描量熱分析圖。其中純的乙基纖維素在175℃左右有一個較明顯的臺階，是乙基纖維素的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。而包埋醋酸鈉后的乙基纖維素在此溫度區(qū)間沒有出現(xiàn)玻璃化轉(zhuǎn)變臺階，說明醋酸鈉與乙基纖維素之間發(fā)生了物理的或化學的相互作用。純的乙基纖維素在225℃左右有一個小的吸熱峰，說明是乙基的脫出；而包埋醋酸鈉的乙基纖維素吸熱峰值溫度卻向高溫方向移動了，大概在260℃左右出現(xiàn)一個小的吸熱峰，這同樣說明醋酸鈉與乙基纖維素之間的相互作用，導致乙基的脫除溫度變高。

2.6 紅外光譜分析（FTIR）

圖5 紅外光譜圖A：乙基纖維素 B：碳源負載乙基纖維素Fig.5 The infrared spectrum.A：ethyl celluloseB：carbon source loaded ethyl cellulose

圖5 所示是乙基纖維素和負載醋酸鈉的乙基纖維素的紅外光譜圖。由圖4-A所示在1100 cm-1處有仲醇的羥基伸縮振動峰；而包埋醋酸鈉后此處的峰值明顯變?nèi)酰ㄈ鐖D4-B），說明醋酸鈉與乙基纖維素的羥基發(fā)生了化學作用。

3 結論

本項目成功地制備了碳源/微生物協(xié)同負載的緩釋體系，研究證明，碳源顯示較好的緩釋性能；對用竹炭纖維素和菌粉制得的微球的平板菌落檢測，說明微生物成功地被包埋進去并且保持了較良好的繁殖能力。