護(hù)骨膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠五臟和胸腺的影響※

● 鐘佳賢 林澤苗 賈歡歡 吳玉娥 曾業(yè)文 李青南，▲

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性代謝性骨病，其特征在于骨量低和骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加而易發(fā)骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加了國家的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。中醫(yī)學(xué)上并無骨質(zhì)疏松癥的病名，“骨痿”“骨枯”“骨痹”與此癥相近。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制與腎臟密切相關(guān)，其次與脾胃、肝臟、血瘀等相關(guān)[2-4]，中醫(yī)的治療方法是滋補(bǔ)肝腎、健脾益氣、活血化瘀。中藥在骨質(zhì)疏松癥的治療中具有多靶點(diǎn)、多途徑、整體調(diào)節(jié)的優(yōu)點(diǎn)，在緩解癥狀、增加骨量、防治骨質(zhì)疏松性骨折等方面效果顯著[5-6]。然而，近年來，有報(bào)道稱中藥引起的不良反應(yīng)以及藥源性疾病時(shí)有發(fā)生，其中不乏有肝腎功能損害的報(bào)道[7]，醫(yī)藥工作者對(duì)中藥的安全性給予了廣泛的關(guān)注。

護(hù)骨膠囊上市11年來，現(xiàn)代研究不斷進(jìn)行，關(guān)于去勢雌性大鼠致骨質(zhì)疏松模型的骨骼及骨重建狀態(tài)、血清骨代謝指標(biāo)、鈣相關(guān)激素和性激素的影響[8-11]等已發(fā)表相關(guān)論文，現(xiàn)進(jìn)一步觀察其對(duì)去勢雌性大鼠主要臟器的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)藥物護(hù)骨膠囊(廣東安諾藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，專利號(hào)：ZL03117768.9，批號(hào)：20150101)。

1.2動(dòng)物50只3個(gè)月大的SPF級(jí)雌性非妊娠SD大鼠，體重(210±3)g。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：44007200017783。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所的籠子中，每籠3～4只(室溫23～27℃；相對(duì)濕度58%～60%)。

1.3試劑甲醛溶液、石蠟、二甲苯、無水乙醇、鹽酸乙醇、TO生物制片透明劑、蘇木精液、伊紅液、中性樹膠。

1.4儀器EG1150H+C Leica組織包埋機(jī)、TP1020 Leica自動(dòng)脫水機(jī)、RM2255 Leica全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)、HI1210 Leica攤片機(jī)、HI122 Leica烘片機(jī)、DM55 Leica生物顯微鏡，均購自德國徠卡儀器公司。

1.5實(shí)驗(yàn)方法按隨機(jī)函數(shù)將大鼠分為5組：假手術(shù)組(Sham組)、卵巢切除組(OVX組)和護(hù)骨膠囊低劑量組(HG-L組)、護(hù)骨膠囊中劑量組(HG-M組)、護(hù)骨膠囊高劑量組(HG-H組)，每組10只。假手術(shù)組將SD雌性大鼠在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，使用2%戊巴比妥鈉注射腹腔，去除卵巢周圍的部分脂肪，而其它組按照相同的方法操作，麻醉后去除雙側(cè)卵巢。手術(shù)后2天開始給藥，Sham組和OVX組灌服生理鹽水[10ml/(kg·d)]，HG-L、HG-M和HG-H組分別灌服等體積的護(hù)骨膠囊[分別為0.243g/(kg·10ml·d)、0.486g/(kg·10ml·d)、0.972g/(kg·10ml·d)]。其中，HG-M組是臨床成人的等效劑量。每天1次，共計(jì)3個(gè)月。每組大鼠用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水喂養(yǎng)，稱量體重并每周記錄1次，根據(jù)體重增加給藥劑量。各組大鼠給藥3個(gè)月后，用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)的方法測量，與Sham組比較，OVX組大鼠的松質(zhì)骨骨量減少，骨結(jié)構(gòu)變差，動(dòng)態(tài)參數(shù)分析表明骨形成率增加，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)增加，呈骨高轉(zhuǎn)換，提示實(shí)驗(yàn)造模成功[8]。

在藥物干預(yù)結(jié)束時(shí)，用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，用注射器抽取右心室的血液，分別取出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺。主要臟器去除多余的脂肪和其它組織，并在相同條件下稱重。記錄數(shù)據(jù)后，按編號(hào)將組織置于10%的甲醛溶液固定24h，沖洗6h后，將一小部分心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺置于70%乙醇進(jìn)行組織脫水，然后用包埋機(jī)包埋在石蠟中。用切片機(jī)將主要臟器組織切出4μm薄片，用蘇木素-伊紅染液對(duì)切片染色，切片烘干后用顯微鏡觀察拍片。

2 結(jié)果與分析

2.1護(hù)骨膠囊對(duì)大鼠主要臟器重量的影響使用護(hù)骨膠囊3個(gè)月后，OVX組脾臟重量與Sham組相比顯著增加(P<0.01)，胸腺重量明顯下降(P<0.05)；與OVX組相比，HG-L組胸腺和HG-M組脾臟重量明顯增加(P<0.05)，其它組變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與HG-L組相比，HG-H組的胸腺重量明顯下降；與HG-M組相比，HG-H組的脾臟重量明顯下降。見表1。

表1 應(yīng)用護(hù)骨膠囊對(duì)SD大鼠器官重量的影響

注：與Sham組比較，*P<0.05，**P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01；與HG-L組比較，□P<0.05，□□P<0.01；與HG-M組比較，◇P<0.05，◇◇P<0.01

2.2護(hù)骨膠囊對(duì)大鼠心、肝、肺、腎、胸腺和脾臟組織形態(tài)的影響

2.2.1 心臟的組織形態(tài)變化 藥物組使用3個(gè)月對(duì)心臟組織形態(tài)的影響主要是細(xì)胞輕度水腫。Sham組的心肌細(xì)胞有橫紋，呈短圓柱形狀，有分支，并且核的形狀像橢圓形或矩形。與Sham組比較，OVX組心臟無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H組心肌細(xì)胞略有水腫，無其它病理改變。見圖1。

圖1 各組對(duì)大鼠心臟的影響(4um×10)

2.2.2 肝臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個(gè)月對(duì)肝臟無明顯影響。Sham組肝細(xì)胞呈臍帶狀，多角形，有肝小葉結(jié)構(gòu)，門靜脈區(qū)無擴(kuò)大，沒有炎癥反應(yīng)，肝板排列整齊。與Sham組比較，OVX組肝臟無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H的肝臟沒有顯著變化。見圖2。

圖2 各組對(duì)大鼠肝臟的影響(4um×10)

2.2.3 脾臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個(gè)月對(duì)脾臟無明顯的影響。Sham組有一定數(shù)量的淋巴結(jié)，脾竇內(nèi)含有少量的鐵血黃素。與Sham組比較，OVX組脾臟無明顯變化；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組脾臟無明顯變化。見圖3。

圖3 各組對(duì)大鼠脾臟的影響(4um×10)

2.2.4 肺的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個(gè)月對(duì)肺的影響主要是細(xì)胞水腫和靜脈瘀血。Sham組的肺泡細(xì)胞呈立方形或圓形，肺靜脈富含血液。與Sham組相比，OVX組肺泡細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫和肺靜脈充血；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組肺無明顯變化，見圖4。

圖4 各組對(duì)大鼠肺臟的影響(4um×10)

2.2.5 腎臟的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個(gè)月對(duì)腎臟無明顯影響。Sham組的腎小管細(xì)胞是單層立方上皮細(xì)胞，腎小球系膜胞體呈梭形或不規(guī)則星形和三角形。與Sham組相比，OVX組腎小管細(xì)胞無明顯變化；與OVX組相比，HG-L、HG-M和HG-H組腎小管細(xì)胞無明顯變化。見圖5。

圖5 各組對(duì)大鼠腎臟的影響(4um×10)

2.2.6 胸腺的組織形態(tài)變化 卵巢切除組和藥物組使用3個(gè)月對(duì)胸腺無明顯影響。Sham組胸腺的胸腺囊較薄，皮質(zhì)較厚，皮質(zhì)和髓質(zhì)明確，皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞密集，偶見凋亡細(xì)胞或凋亡小體。在髓質(zhì)中可以看到由上皮細(xì)胞組成的更多胸腺體。與Sham組比較，OVX組胸腺無明顯變化；與OVX組比較，HG-L、HG-M和HG-H組胸腺無明顯變化。見圖6。

圖6 各組對(duì)大鼠胸腺的影響(4um×10)

3 討論

在現(xiàn)有文獻(xiàn)中，中成藥對(duì)去勢大鼠影響的研究主要集中在骨骼方面，目前對(duì)其主要臟器的報(bào)道并不多見，但有糖皮質(zhì)激素對(duì)大鼠軟組織和免疫系統(tǒng)的研究[12]。本研究旨在探討護(hù)骨膠囊對(duì)SD大鼠主要臟器的影響，為藥物的安全性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)果顯示，卵巢切除組脾臟重量與假手術(shù)組相比顯著增加，而胸腺重量明顯下降；與卵巢切除組相比，護(hù)骨膠囊中劑量組脾臟和護(hù)骨膠囊低劑量組胸腺重量明顯增加。脾臟和胸腺都是機(jī)體最重要的免疫器官，在免疫功能調(diào)控中擔(dān)任重要角色。脾臟、胸腺重量是代表脾臟和胸腺大部分形態(tài)的重要指標(biāo)，而形態(tài)結(jié)構(gòu)可以大致反映器官的功能狀態(tài)。卵巢切除后脾臟重量增加，這和玫參顆粒對(duì)圍絕經(jīng)期大鼠內(nèi)分泌-免疫功能的影響中去卵巢后大鼠免疫器官脾臟系數(shù)降低的研究結(jié)果不符[13]，和張婷婷等[14]關(guān)于雌激素預(yù)防性給藥對(duì)去卵巢大鼠骨和臟器的影響中所得出的摘除大鼠卵巢會(huì)導(dǎo)致脾臟指數(shù)增加的研究結(jié)果相符，具體原因不明，有待深入研究。而胸腺重量明顯下降，這與衰老動(dòng)物模型可導(dǎo)致大鼠脾臟和胸腺結(jié)構(gòu)與功能損傷，重量和指數(shù)都是降低的研究結(jié)果相符[15-16]。

相對(duì)OVX組，HG-M組治療后，脾臟重量明顯增加，HG-L組治療后，胸腺重量明顯增加，接近Sham組，HG-H組治療后，脾臟和胸腺無明顯變化。結(jié)果提示護(hù)骨膠囊中劑量和低劑量可能對(duì)脾臟和胸腺這兩大免疫器官有調(diào)節(jié)作用，推測原因是護(hù)骨膠囊組方中含有當(dāng)歸，而當(dāng)歸多糖在延緩大鼠的免疫系統(tǒng)衰老或損傷的機(jī)制中有一定的作用[14]，且護(hù)骨膠囊組方中的淫羊藿、制何首烏、熟地黃、龜甲、山藥和杜仲都有提高免疫功能的現(xiàn)代藥理學(xué)研究。護(hù)骨膠囊低、中、高劑量治療后，基本改變?yōu)樾募〖?xì)胞輕度水腫，給藥組心肌細(xì)胞略有水腫、卵巢切除組的肺泡細(xì)胞出現(xiàn)輕度水腫和肺靜脈充血，其它臟器的組織形態(tài)學(xué)沒有發(fā)生明顯的病理改變。給藥組與卵巢切除組比較無明顯變化，表明護(hù)骨膠囊對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠主要臟器沒有損傷。

綜上所述，本研究以去勢SD雌性大鼠主要臟器為考察對(duì)象，探究復(fù)方中藥護(hù)骨膠囊作用下主要臟器的影響。結(jié)果表明，護(hù)骨膠囊中劑量和低劑量治療后，脾臟和胸腺重量明顯增加，提示可能對(duì)脾臟和胸腺這兩大免疫器官有調(diào)節(jié)作用，推測是護(hù)骨膠囊組方中含有淫羊藿、制何首烏、熟地黃、龜甲、山藥和杜仲，這些藥材對(duì)免疫器官有影響。而HG-H組對(duì)這兩個(gè)臟器無明顯影響。去勢大鼠主要臟器的組織形態(tài)在灌服護(hù)骨膠囊低、中、高劑量3個(gè)月后未有明顯的病理變化，提示護(hù)骨膠囊的臨床用藥安全性。研究僅涉及到護(hù)骨膠囊對(duì)主要臟器重量和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，沒有涉及軟組織的指數(shù)，且尚未深入到對(duì)軟組織細(xì)胞學(xué)和相關(guān)蛋白組織的研究，還不夠全面，有待深入研究。本研究能為臨床應(yīng)用護(hù)骨膠囊提供安全性的證據(jù)，為骨質(zhì)疏松癥的防治開拓更安全有效的藥物提供更多選擇。