利用微衛星和線粒體D-loop區聯合分析大尾寒羊的遺傳多樣性

劉澤民 王巖超 張淑二 劉展生 姜運良*

利用微衛星和線粒體D-loop區聯合分析大尾寒羊的遺傳多樣性

劉澤民①王巖超①張淑二②劉展生②姜運良①*

（①山東農業大學動物科技學院 山東 泰安 271018 ②山東省畜牧總站 山東 濟南）

本研究對42只大尾寒羊的10個微衛星標記進行了遺傳多樣性分析，并對其中38只個體的線粒體DNA D-loop區的進行了測序和多態性分析。結果表明，10個微衛星位點共發現38個等位基因，平均觀察雜合度為0.3631，平均PIC值為0.416，FST、FIS和FIT平均值分別為0.0842、0.1784和0.2466，且該群體的HO

大尾寒羊 微衛星 線粒體D-loop區 遺傳多樣性

大尾寒羊是我國華北地方品種羊，公母羊的尾都過飛節，長者可接地或拖及地面，尾尖向上翻卷，形成明顯尾溝，屬大脂尾羊[1]。作為我國優良綿羊品種，其遺傳價值不容低估。由于保護開發投入不足，加之與其他品種的盲目雜交，導致大尾寒羊在部分地區瀕臨滅絕。妥善保存和利用大尾寒羊基因庫，制訂合理的保種方案，擴大其存欄數量已成為我省畜牧業生產中迫在眉捷的一項戰略任務[2, 3]。

微衛星DNA是可變數目串狀重復(VNTR)的一種[4]。微衛星具有多態信息含量豐富、雜合度高、共顯性遺傳、等位基因數目多、在畜群基因組DNA中分布廣泛等優點[5, 6]。線粒體DNA (mitochondrial DNA, mtDNA)是存在于線粒體基質中的、獨立于細胞核染色體外的基因組，與核基因相比，mtDNA 具有結構簡單、以母性方式遺傳、進化速度快和極少發生重組等特點[7-10]。其中D-loop區的進化速度最快，變異較大，適用于進行亞科內屬、種間的系統學研究[11, 12]。

本研究分析了微衛星和線粒體D-loop區的多態性，旨在為大尾寒羊的種質資源保護提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

42只大尾寒羊(包括27只母羊和15只公羊)于2016年3月31日采自山東省臨清市大尾寒羊保種場，每只羊頸靜脈采血15ml于自帶肝素鈉的采血管中，保存在-20℃冰箱中以備提取基因組。

1.2 方法

1.2.1 微衛星DNA的多態性分析 選取的10個微衛星來源于GeneBank，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應總體系為25μl，包括10×Ex Taq Buffer 2.5μl，d NTPs 2μl，上下游引物(1μM)各0.5μl，基因組 DNA(50~100ng)2μl，Ex Taq 0.25μl，滅菌ddH2O 17.25μl。PCR反應條件為95℃5min；94℃30s，50~60℃30s，72℃ 30s，38個循環；72℃延伸10min。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。選擇12%的非變性聚丙烯酰氨凝膠進行檢測。預電泳結束后，取5μl PCR產物與3μl 6× Loading Buffer混勻，上樣，160~180V電壓，電泳12~16h，硝酸銀染色，拍照。

1.2.2 線粒體DNA D-loop區的擴增與測序 根據NCBI數據庫提交的綿羊線粒體基因組序列(KR868678)設計擴增大尾寒羊線粒體D-loop區部分序列的特異引物。上下游引物序列分別為F：CCACTATCAACACCCAA，R：CGAAGGGCGT TACTCACC。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.3 分型分析與序列分析 利用Cervus3.0計算大尾寒羊群體10個微衛星位點的觀察雜合度、多態信息含量(FIC)、哈代—溫伯格平衡等，對大尾寒羊多樣性進行評估。利用FSTAT3.9.2計算大尾寒羊總群體的近交系數(FIT)、不用亞群間的遺傳分化程度(FST)、群內近交系數(FIS)等遺傳多樣性參數。測得的線粒體D-loop區序列用DNA MAN6.0軟件進行整理對比，并進行人工校對。用DNAsp5.0軟件統計單倍型及變異位點、計算單倍型多樣性( Hd) 及核苷酸多樣度(Pi)等，評價群體遺傳多樣性水平。采用MEGA5.0軟件計算單倍型間的遺傳距離，并構建UPGMA分子系統樹。

表1 綿羊微衛星標記引物及退火溫度

2 結果

2.1 微衛星DNA的多態性分析

2.1.1 微衛星位點的PCR擴增及多態性檢測 擴增結果顯示共有38個等位基因，平均每個位點有3.8個，其中在OarCP20位點檢測到的等位基因數最多(8個)，在CSRD247、OarCP34、McM527和HSC四個位點檢測到的等位基因數最少(2個)。CSRD247位點的基因分析的結果如圖1所示。

圖1 微衛星CSRD247的PCR擴增產物PAGE膠圖

2.1.2 微衛星座位的遺傳參數 （1）所有微衛星座位上有效等位基因占85.11%，各位點平均有效等位基因數范圍在0.3306~0.9151之間，與有效等位基因數相差較大，表明等位基因分布不均勻，可能與人工選育有關。（2）我們選了檢測到的3個高度多態性位點和5個中度多態性位點來分析遺傳多樣性。這在這8個位點中有37.5%的位點偏離了哈代－溫伯格平衡，6個位點的期望雜合度都超過觀察雜合度(HO

表2 微衛星位點的觀察雜合度、期望雜合度、多態信息含量和哈代-溫伯格平衡

注：***為0.1%顯著性水平偏離哈代-溫伯格平衡，**為1%顯著性水平偏離哈代-溫伯格平衡，*為5%顯著性水平偏離哈代-溫伯格平衡，NS為不顯著偏離哈代-溫伯格平衡；ND 沒有做H-W檢測

FST值代表整個群體不同亞群間的遺傳分化程度，在8個所選的位點中，FST值在0.015到0.278之間，平均值為0.0842；群內近交系數(FIS)顯示大部分位點的近交系數為正值，平均值為0.1784；FIT值用來表示總群體的近交系數，其平均值為0.2466(表3)。

表3 群體的遺傳多樣性參數

2.2 mtDNA D-loop區多態性分析

2.2.1 mtDNA D-loop區序列擴增 根據普通綿羊線粒體DNA序列設計的引物在大尾寒羊基因組中得到較好的擴增(圖2)。PCR產物片段單一，擴增片段大小與預期的產物片段大小一致，可用于后續的測序分析。

圖2 大尾寒羊mtDNA D-loop區的擴增結果

2.2.2 mt DNA D-loop序列的遺傳多樣性 測序分析了其中38只D-loop區擴增結果較為理想的個體。結果顯示38個個體分別屬于23種單倍型(表4)。D-loop區堿基組成A+T的平均含量(62.0%)明顯高于G+C的平均含量(34.6%)，轉換/顛換值為2.90，遺傳多樣性指數如表4所示。

表4 大尾寒羊mt DNA D-loop部分序列的遺傳多樣性指數

2.3 單倍型之間的遺傳距離及分子系統樹

應用MEGA軟件，根據線粒體D-loop序列計算了23個單倍型之間的遺傳距離，單倍型的平均遺傳距離為0.37，其中有8組遺傳距離≤0.01，單倍型9、11的遺傳距離最大，為20.294。單倍型12、13為最小遺傳距離0.0055，絕大部分的遺傳距離在0~2之間(表5)。通過軟件構建了大尾寒羊單倍型間的UPGMA分子系統樹(Bootstrap檢驗重復為1000次)。由圖3可以看出，23種單倍型最終聚為3大分支。單倍型8與其他單倍型的同源性都有較遠距離。

圖3 大尾寒羊群體的UPGMA分子系統樹

表5 大尾寒羊mt DNA D-loop部分序列單倍型間的遺傳距離

3 討論

3.1 微衛星DNA的多態性分析

（1）利用微衛星標記來探究種群的遺傳多樣性時，雜合度能夠反映群體在多個基因座位上的變異，它是衡量群體遺傳變異的一個最適參數[3~ 13]。在本研究中，10個標記的平均觀察雜合度為0.3631，期望雜合度均在0.3以上的座位有8個，觀察雜合度在0.3以上的座位有7個，與Takezaki和Nei(1996)認為微衛星計算出的雜合度范圍為0.3~ 0.8基本吻合[14]。多態信息含量(PIC)是基因豐富度的一個指標，多態信息含量的高低表明了品種遺傳基礎的豐富多樣性，用多態信息含量來描述種群在微衛星位點上的變異程度，當PIC>0.5時，該位點為高度多態；0.5>PIC>0.25時，該位點中度多態；PIC<0.25時，為低度多態[15, 16]。在所選用的10個微衛星多態位點的多態信息含量中HSC為和McM527低度多態，MAF214、OarFCB20和OarCP20為高度多態，其余基因座的多態信息含量為中度多態，所有位點的平均PIC值為0.416，說明所選擇的微衛星基因座位的多態性中等。（2）由于上述10個微衛星位點不論是PIC值還是雜合度，變化范圍都很大，不利于對大尾寒羊群體的遺傳多樣性進行評估。又分析了FIT、FST和FIS3個遺傳參數。FST值代表整個群體不同亞群間的遺傳分化程度，取值范圍從0~1，其值越大，表明亞群間遺傳分化越明顯。一般評價標準是FST<0.05，代表群體分化較小；0.05 HE，FIS<0時，說明群體存在一定程度的遠交或者雜交現象；反之，當HO0時，說明群體內存在一定程度的近交現象。由表5可以看到，大部分位點的近交系數為正值，平均值為0.1784；同時，由于該群體HO

3.2 mtDNA D-loop區多態性分析

本實驗由于保種場內樣品數量有限，品種間親緣關系混雜，抽樣效率低，繼而利用線粒體DNA D-loop區部分序列進行了分析，明確種群內個體的親緣關系及遺傳多樣性。應用mtDNA測序技術來研究物種的遺傳多樣性時，通常用兩個重要指標來衡量一個群體mtDNA的遺傳變異程度，單倍型間的平均遺傳距離(P)和核苷酸多樣性(π)[7, 20]。一般來說大多數哺乳動物的P值都在0.01以上時被認為變異大[21]。本研究顯示，群體單倍型間的平均遺傳距離為0.37，大于0.01，這說明中大尾寒羊的遺傳變異較大。核苷酸多樣性(π)是指群體內兩個隨機個體mtDNA序列間平均每個位點的核苷酸差異數目。Nei等定義，給定群體內兩個隨機選取的mtDNA序列間π值越小，表明群體的遺傳多樣性越低。本研究中，中大尾寒羊群體mtD NAD-loop區的核苷酸多樣性(π)為0.02815，高于Lan等認為的低遺傳多樣性指標(π值在0.0015 ~0.0047)[23]，但低于山東其他綿羊品種，小尾寒羊(0.0324)與洼地綿羊(0.03172)[24]，就其分子進化樹來看，三個分支內部的遺傳距離相對較近，存在近交現象。

總的來說該大尾寒羊種群雖然遺傳多樣性相對較高，但群體內部存在一定程度的近交現象，在大尾寒羊育種工作中，應避免遺傳距離較近的家系間的交配，進一步加大大尾寒羊保護、開發和利用力度，有效維持大尾寒羊這一國家保護品種的基本數量與質量。

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（2019–04–09）

S813.3

A

1007-1733(2019)07-0001-05