斑點追蹤成像評價膿毒癥大鼠早期心肌損傷及柚皮苷預處理效果

孫立娟，任衛東，喬 偉，肖楊杰，崔 莉

(1.中國醫科大學附屬盛京醫院超聲科，遼寧 沈陽 110004；2.秦皇島市第一醫院超聲科，河北 秦皇島 066000)

脂多糖(lipopolysaccharide， LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要成分，可引起人或動物膿毒癥[1]。早期器官功能障礙是膿毒癥患者死亡的主要原因，心臟是易受累器官之一。柚皮苷(naringin， Nar)是天然黃酮類化合物，具有多種生物學活性，如抗感染、抗凋亡、神經保護、抗動脈粥樣硬化等[2-3]。斑點追蹤成像(speckle tracking imaging， STI)技術應變及應變率等參數對評價心肌早期損傷具有較高敏感性[4]，但用于膿毒癥心肌損傷的研究較少。本研究探討STI技術評價LPS誘導膿毒癥大鼠早期心肌損傷及Nar預處理對逆轉心肌損傷效果的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠36只，8周齡，體質量285～305 g，購于北京華阜康生物技術股份有限公司[動物許可證號：SYXK(遼)2017-0004]。本研究經中國醫科大學附屬盛京醫院動物倫理委員會批準。

1.2 動物模型建立及分組 將36只SD大鼠隨機分為LPS+Nar50組(n=9)、LPS+Nar100組(n=9)、LPS組(n=10)及對照組(n=8)。對LPS+Nar50組、LPS+Nar100組大鼠分別灌胃給予50、100 mg/kg體質量Nar混懸液(Sigma)，對照組、LPS組灌胃給予等量生理鹽水；4組大鼠均每日灌胃1次，連續7天，最后一次灌胃后1 h，LPS+Nar50組、LPS+Nar100組及LPS組均腹腔注射5 mg/kg體質量LPS(Sigma)，對照組給予等量生理鹽水。

1.3 儀器與方法 采用GE Vivid E9超聲診斷儀，12S探頭，頻率9～12 MHz，幀頻120～200幀/秒，于LPS/生理鹽水注射6 h后對4組大鼠行戊巴比妥鈉(30 mg/kg體質量)麻醉，將大鼠左側臥位保定于檢查床，連接同步肢體導聯心電圖，獲取超聲參數。采用改良Simpson法檢測左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF)，組織多普勒顯像檢測室間隔側二尖瓣環運動頻譜，計算Tei指數，均取3個心動周期的平均值作為結果。

連續采集5個心動周期左心室乳頭肌水平短軸切面圖像，采用EchoPAC工作站進行分析，手動勾勒ROI，調節ROI直徑至各節段均顯示滿意，系統自動將心肌分為心內膜下心肌、中間心肌層及心外膜下心肌區域，獲得前間隔、前壁、側壁、后壁、下壁及后間隔各節段圓周應變(circumferential strain, SC)峰值，左心室心內膜、中間層及心外膜下心肌整體SC(global circumferential strain, GSC)峰值(分別記為GSCendo、GSCmid、GSCepi)、收縮期圓周應變率(circumferential strain rate, SrC)峰值(SrC S)、舒張早期SrC峰值(SrC E)、舒張晚期SrC峰值(SrC A)，結果取5個心動周期的平均值。見圖1。

1.4 心肌酶檢測 于超聲檢查后麻醉狀態下以毛細管行眼眶采血，采用全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)水平。

1.5 心肌組織病理學檢查 眼眶取血后處死所有大鼠，取左心室中間段心肌以10%多聚甲醛固定，常規切片后HE染色觀察病理改變。

1.6 統計學分析 采用SPSS 19.0統計分析軟件。符合正態分布的計量資料以±s表示，4組大鼠左心室各節段SC峰值、GSC峰值、SrC峰值、LVEF、Tei指數及CK、LDH比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

造模6 h后，對照組大鼠無明顯異常，其余3組大鼠均見食欲下降、行動遲緩。LPS組大鼠呼吸增快，精神萎靡，嗜睡，豎毛，排稀水樣便等；LPS+Nar50組、LPS+Nar100組大鼠一般狀況較LPS組輕，LPS+Nar50組大鼠精神稍萎靡，豎毛，排少量稀水樣便，LPS+Nar100組大鼠精神尚好，排少量稀水樣便。LPS組2只、LPS+Nar50組及LPS+Nar100組各1只因聲像圖質量差被剔除。

2.1 左心室各節段SC峰值 4組大鼠左心室各節段SC峰值比較總體差異均有統計學意義(P均<0.001)。LPS組左心室各節段SC峰值均低于對照組和LPS+Nar100組；LPS+Nar50組前間隔、前壁、下壁及后間隔SC峰值均高于LPS組，均低于LPS+Nar100組；LPS+Nar50組側壁SC峰值低于LPS+Nar100組；組間差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表1。

2.2 左心室整體SC峰值及SrC峰值 4組左心室GSCendo、GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A比較總體差異均有統計學意義(P均<0.01)。LPS組GSCendo、GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A均低于其余3組(P均<0.05)；LPS+Nar50組GSCmid、SrC S、SrC E及SrC A均低于LPS+Nar100組(P均<0.05)。見表2、圖1。

2.3 LVEF、Tei指數及CK、LDH 4組LVEF、Tei指數、CK及LDH比較總體差異均有統計學意義(P均<0.001)。LPS組Tei指數、CK及LDH均高于其余3組，LVEF均低于其余3組(P均<0.05)；LPS+Nar50組Tei指數、CK及LDH均高于LPS+Nar100組，LVEF低于LPS+Nar100組(P均<0.05)。見表3。

表1 4組大鼠左心室各節段SC峰值比較(%，±s，n=8)

表1 4組大鼠左心室各節段SC峰值比較(%，±s，n=8)

組別SC峰值前間隔前壁側壁后壁下壁后間隔LPS組-6.76±4.01*-6.94±2.56*-5.87±2.10*-8.07±2.59*-4.08±3.17*-5.44±2.22*LPS+Nar50組-10.96±1.85#-10.61±2.00#-8.09±2.62-11.81±2.10-8.67±3.52#-8.84±2.62#LPS+Nar100組-17.01±3.58#△-15.49±2.74#△-11.23±2.69#△-13.21±2.47#-13.13±2.78#△-14.26±2.73#△對照組-23.99±2.60-17.01±3.58-18.00±3.55-16.55±3.87-20.61±4.32-21.77±3.99F值46.01515.25228.67812.23113.16246.092P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS+Nar50組比較，P<0.05

表2 4組大鼠左心室各層SC及SrC比較(±s，n=8)

表2 4組大鼠左心室各層SC及SrC比較(±s，n=8)

組別GSCendo(%)GSCmid(%)GSCepi(%)SrC S(s-1)SrC E(s-1)SrC A(s-1)LPS組-13.96±3.43*-7.16±3.28*-5.15±2.37-5.59±1.01*5.07±1.28*3.07±1.66*LPS+Nar50組-21.71±3.58#-9.84±2.26#-6.31±1.87-8.00±1.68#7.82±0.72#6.05±2.07#LPS+Nar100組-23.08±2.33#-12.83±1.66#△-5.95±1.87-10.27±1.31#△9.16±0.92#△8.04±1.11#△對照組-24.04±3.06-14.03±2.64-6.78±2.07-10.85±2.2911.74±1.958.77±1.43F值5.06711.9120.89416.99736.17620.148P值0.006<0.0010.457<0.001<0.001<0.001

注：*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS+Nar50組比較，P<0.05

表3 大鼠LVEF、Tei指數及CK、LDH比較(±s，n=8)

表3 大鼠LVEF、Tei指數及CK、LDH比較(±s，n=8)

組別LVEF(%)Tei指數CK(U/L)LDH(U/L)LPS組55.00±3.16*0.71±0.02*3 346.50±297.32*2 856.25±380.00*LPS+Nar50組65.63±2.50#0.64±0.03#2 015.00±224.04#2 095.50±339.65#LPS+Nar100組75.38±2.50#△0.59±0.02#△1 209.50±239.90#△1 343.13±257.18#△對照組81.75±5.340.50±0.03394.25±173.21699.00±152.10F值85.65697.658223.98979.863P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：*：與對照組比較，P<0.05；#：與LPS組比較，P<0.05；△：與LPS+Nar50組比較，P<0.05

圖1 大鼠左心室乳頭肌水平整體SC曲線 A.對照組； B.LPS組； C.LPS+Nar50組； D.LPS+Nar100組

2.4 心肌組織病理檢查 對照組心肌纖維肌絲束排列整齊，細胞結構正常，橫紋清晰；LPS組心肌部分細胞核固縮，心肌纖維部分斷裂，充血明顯，炎性細胞增多；LPS+Nar50組、LPS+Nar100組上述病理改變較LPS組明顯減輕，與LPS+Nar50組相比，LPS+Nar100組心肌纖維肌絲束排列尚整齊，充血不明顯，炎性細胞明顯減少。見圖2。

3 討論

膿毒癥早期即可發生心肌損傷，LPS可誘發膿毒癥心肌損傷，主要機制為LPS刺激免疫細胞，激活免疫應答，導致多種促炎因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、白細胞介素1β(interleukin-1β, IL-1β)等生成增加[5]，并降低心肌收縮力，造成心肌損傷。本研究給予大鼠腹腔注射LPS后，大鼠呼吸增快、精神萎靡、嗜睡、豎毛、排稀水樣便，LVEF減低，Tei指數升高，心肌酶CK、LDH表達上調，心肌組織部分細胞核固縮，心肌纖維部分斷裂，充血明顯，炎性細胞增多，表明大鼠心肌細胞損傷，提示造模成功。

LPS組左心室各節段SC峰值及各時相SrC峰值均較對照組減低，曲線低平，而Nar預處理組SC及SrC峰值均升高，表明LPS損傷大鼠心肌收縮期、舒張早期及晚期圓周運動，Nar能夠緩解上述心肌損傷。圓周運動反映心臟短軸方向的環形運動，于收縮期縮短、舒張期延長，是左心室心肌重要的運動形式之一。Narayan等[6]報道，SC聯合心室-動脈耦聯可用于預測化療藥物導致的心肌功能不全。左心室心肌分為心內膜、中間層及心外膜3層，STI技術能夠評價整體心肌的運動，亦能評價分層心肌應變，且無角度依賴性。相對于整體應變，分層應變更符合左心室心肌的3層肌帶解剖結構，結果更客觀。本研究4組大鼠GSC由內到外均逐漸減低，由于3層心肌存在跨壁速度梯度，心內膜下心肌為向心運動，且處于冠狀動脈供血的最遠端，缺乏側支循環，受收縮期心肌壓迫明顯，因此缺血最顯著，而心外膜下心肌在心肌收縮時相對靜止[7-8]；給予LPS后大鼠左心室GSCendo及GSCmid均較對照組減低，提示大鼠心肌明顯受損，其中心內膜下心肌及中間層心肌受損為著。

圖2 大鼠心肌組織病理圖(HE，×400，箭示炎性細胞浸潤) A.對照組； B.LPS組； C.LPS+Nar50組； D.LPS+Nar100組

Nar屬于天然黃酮類化合物，具有多種生物學活性和藥理特性。攝入富含黃酮類化合物的食物可減少心血管疾病發生率及死亡率[9]。Nar可抑制阿霉素致大鼠心肌損傷，增強線粒體復合物(Ⅰ～Ⅳ)活性、改善氧化應激可能是其作用機制[10]。You等[11]發現Nar促進B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)表達，抑制炎癥通路核轉錄因子κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)磷酸化及細胞凋亡因子半胱天冬酶3(caspase-3)、Bcl2-相關X蛋白(Bcl2-associated X protein, Bax)表達，進而對高糖引起的心肌損傷發揮保護作用。本研究中，與LPS組比較，LPS+Nar50組、LPS+Nar100組大鼠一般狀況好轉，CK、LDH水平降低，LVEF升高，Tei指數降低，左心室各節段SC峰值及GSCendo、GSCmid均升高，心肌組織病理改變減輕，提示Nar預處理可抑制LPS誘導的心肌損傷。

本研究的局限性：所用12S嬰幼兒探頭非小動物專用探頭，但大鼠胸壁薄，分辨率尚好；大鼠心臟相對于嬰幼兒小，且心率更快，在左心室短軸各切面分界不甚明顯，故選用乳頭肌水平切面SC作為左心室短軸GSC，大鼠四腔心切面心尖部分顯示較差而未納入長軸縱向應變；關于Nar通過何種分子機制發揮心肌保護作用尚需進一步研究。

總之，STI技術可用于評價LPS誘導膿毒癥大鼠早期心肌損傷及Nar預處理減輕心肌損傷的效果。