TOX3基因RNAi慢病毒載體的構建及對乳腺癌ZR-75-1細胞增殖的影響

韓翠翠 劉立琨 王玉春 楊瑩 劉吉成 周忠光

（1. 齊齊哈爾醫學院藥學院，齊齊哈爾 161006；2. 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，哈爾濱 150040；3. 齊齊哈爾醫學院醫藥科學研究院，齊齊哈爾 161006）

TOX高遷移率蛋白盒家族成員（TOX highmobility box protein group family member3，TOX3）基因為高遷移率蛋白（High mobility group，HMG）家族成員之一。2007年，Easton等［1］通過全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS）發現其與乳腺癌易感性相關。隨后，在不同人群的GWAS研究中進一步證實了TOX3與乳腺癌的發展存在強烈的相關性［2-14］。研究發現其在乳腺癌組織中通常過表達，而在正常乳腺組織中低表達或表達缺失［15］，且與臨床TNM分期分級密切相關，與乳腺癌淋巴結轉移也存在相關性［16］。但其在乳腺癌惡性病變進程中所發揮的具體生物學功能尚不明確。因此，構建穩定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞模型對于深入研究其在乳腺癌發生發展過程中的作用及機制則尤為重要。

本研究擬構建TOX3 RNAi慢病毒表達載體，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率，采用實時熒光定量PCR及Western blot檢測轉染后ZR-75-1細胞內TOX3 mRNA及蛋白表達水平，構建穩定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞模型，并初步探討干擾TOX3基因的表達對乳腺癌細胞增殖的影響，旨為進一步深入研究TOX3基因在乳腺癌發展進程中的生物學功能奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌ZR-75-1細胞、人腎上皮293T 細胞均購于中科院上海細胞庫；胎牛血清、1640培養基和DMEM培養基均購自Gibco公司；慢病毒載體質粒、包 裝 質 粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G） 及 RNAi-Mate轉染試劑均購于蘇州吉瑪基因股份有限公司；DNA內切酶（BamHI、EcoRI）和T4 DNA連接酶購自MBI Fermentas公司；DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；中量抽提試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司；嘌呤霉素購自美國Sigma公司；PCR引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，反轉錄試劑盒及實時熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，兔抗人TOX3單克隆抗體購自Abcam公司；抗兔二抗購自美國Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向TOX3基因shRNA慢病毒表達載體的構建 GenBank 搜索TOX3基因序列（NM_00108043-0.2），依據shRNA序列設計原則，設計合成3條干擾靶序列及1條陰性對照序列。退火合成雙鏈DNA，T4 DNA連接酶連接線性化LV3-shRNA載體；制備感受態細胞DH5α；挑取陽性克隆，抽提質粒后進行測序鑒定。靶向TOX3基因干擾序列，如表1所示。

表1 針對TOX3基因的3個干擾靶序列

1.2.2 慢病毒包裝 將293T細胞培養于含有10%FBS、100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM 培養基中，置于37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中常規培養。待其生長到80%左右融合時，將空質粒pGLV3/H1/GFP-Puro、重組質粒pGLV3/H1/GFPPuro-shTOX3、和包裝質粒pGag/Pol、pRev、pVSV-G按比例加入裝有1.5 mL無血清培養基的離心管中，混勻。另將轉染試劑RNAi-Mate加入裝有1.5 mL無血清的培養基中，混勻。室溫放置5 min后，將兩管試劑混勻。室溫放置20-25 min后，去除培養皿中的舊培養液，加入新的無血清培養液，將混合液加入細胞培養液中，于細胞培養箱中培養4-6 h。除去轉染液，加入含血清DMEM培養基，繼續培養72 h。吸取細胞上清液到離心管中，低速離心，0.45 μm過濾，在4℃ 20 000 r/min條件下超速離心2 h，收集濃縮液。

1.2.3 病毒滴度檢測 在檢測病毒滴度前1 d，以3×104個/孔的細胞密度將293T細胞接種于96孔板中。常規培養24 h后，用含有10%FBS的培養基將10 μL慢病毒原液10倍稀釋4個梯度。吸棄96孔板內的舊培養液，加入稀釋好的病毒液，每孔100 μL，于培養箱內培養24 h后，將病毒液吸出，每孔加入完全培養基100 μL，繼續培養72 h。于熒光顯微鏡下計數表達綠色熒光細胞的數目。并結合相應的稀釋倍數計算病毒滴度。

1.2.4 轉染ZR-75-1細胞并建立穩定的細胞系 取生長狀態良好的ZR-75-1細胞，以5×104個細胞/孔的細胞密度接種于24孔板內，加入500 μL完全培養基，過夜。將慢病毒液按照預實驗得到的合適的感染參數（Multiplicity of infection，MOI）加入到含有聚凝胺的400 μL培養基中，使聚凝胺的終濃度為5 μg/mL。同時設立空白對照組（未轉染的ZR-75-1細胞）、陰性對照LV3-NC組（轉染空載體）、TOX3-shRNA-1組、TOX3-shRNA-2組和TOX3-shRNA-3組。12 h后棄掉含有病毒液的培養基，加入完全培養基繼續培養48 h。棄掉舊培養基，加入含有嘌呤霉素2 μg/mL的篩選培養基（經預實驗確定ZR-75-1細胞的最小死亡濃度為2 μg/mL），每2-3 d更換篩選培養基，連續培養7 d，隨后更換為濃度為1 μg/mL的篩選培養基繼續培養。獲得具有抗性的轉染細胞，熒光顯微鏡下觀察表達GFP細胞的比例。篩選出穩定轉染的抗性陽性克隆，擴大培養。所建立的細胞分別命名為TOX3-shRNA-1、TOX3-shRNA-2、TOX3-shRNA-3和LV3-NC。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測ZR-75-1細胞TOX3mRNA的表達 應用Trizol提取各組細胞總RNA，將其逆轉錄為cDNA，應用實時熒光定量PCR儀檢測TOX3 mRNA的表達。PCR反應引物如下：β-actin：上游引物 ：5′-CTGGGACGACATGGAGAAAA-3′，下游引物：5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′；TOX3：上游引物 ：5′-TATGCCTCACACATCTCCTTCA-3′，下游引物 ：5′-ATGGCTCTGTTGGCTTCATC-3′。PCR 反應條件為第一步：95℃ 30 s，1個循環；第二步：變性：95℃ 5 s；退火：60℃ 31 s，40個循環。

1.2.6 Western blot檢測ZR-75-1細胞TOX3蛋白的表達 收集各組細胞，應用RIPA強效裂解液提取各組細胞總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度并定量。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，采用BSA封閉液4℃封閉過夜。加入兔抗人TOX3單克隆抗體（1∶2 000），小鼠抗人GAPDH多克隆抗體（1∶3 000），室溫孵育3 h，TBST洗膜，HRP標記的山羊抗兔二抗（1∶3 000），馬抗小鼠二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST洗膜，ECL顯影，曝光。

1.2.7 MTT法檢測TOX3對細胞增殖能力的影響 將各組細胞以3×103個/孔細胞密度接種于96孔板中，每組設5個復孔，常規培養過夜。次日棄掉舊培養基，每孔加入200 μL新鮮培養基，繼續培養。于檢測當日加入20 μL MTT溶液，37℃孵育4 h。終止培養，小心吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，室溫震蕩使結晶充分溶解。于570 nm波長處，應用酶標儀檢測各孔吸光度值。以時間為橫坐標，測得的吸光度值為縱坐標，繪制第0天至第7天各組細胞的生長曲線。

1.2.8 平板單克隆形成實驗 將各組細胞接種于6孔板內，使細胞密度為3 000個/孔。視細胞生長情況每3-4 d換液一次，連續培養14 d后，除去舊培養基，PBS清洗。加入冰甲醇固定10 min。再用PBS洗2次。加入0.1%結晶紫染色10 min，PBS洗去結晶紫。計細胞數大于50個的集落數，采用凝膠成像分析系統拍照，計算集落形成率。集落形成率（%）=計數細胞集落數/細胞總數集×100%。

2 結果

2.1 重組慢病毒的測序鑒定

抽提3組重組載體質粒，經測序鑒定結果（圖1）顯示，各組質粒序列正確。

2.2 慢病毒表達載體的包裝及滴度檢測

病毒滴度檢測結果（圖2）顯示，經病毒包裝重組質粒 TOX3-shRNA-1，TOX3-shRNA-2，TOX3-shRNA-3的病毒滴度分別為3×108TU/mL，4×108TU/mL和2×108TU/mL。

2.3 轉染效率的測定

經嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察表達GFP的細胞比例。結果（圖3）顯示LV3-NC組、TOX3-shRNA-1組、TOX3-shRNA-2組 和TOX3-shRNA-3組GFP表達均約達到95%以上。

2.4 轉染后ZR-75-1細胞中TOX3 mRNA的表達

實時熒光定量PCR檢測結果（圖4）顯示，與空白對照組比較，空載體LV3-NC組TOX3 mRNA的相對表達無明顯差異（P＞0.05），而與空載體LV3-NC對照組比較，不同的TOX3-shRNA干擾序列均顯示出明顯的干擾效果（P＜0.05），其中TOX3-shRNA-3組的mRNA表達水平最低，干擾效率最高。

圖1 TOX3-shRNA干擾質粒測序圖譜

圖2 重組慢病毒轉染293T細胞后GFP的表達（×40）

圖3 經嘌呤霉素篩選后ZR-75-1細胞的GFP表達（×40）

2.5 Western blot檢測轉染后ZR-75-1細胞TOX3蛋白的表達

蛋白檢測結果（圖5）顯示，與空白對照組比較，空載體LV3-NC組TOX3蛋白的相對表達無明顯差異（P＞0.05）。與空載體LV3-NC對照組比較，不同干擾序列TOX3蛋白的表達水平均明顯降低（P＜0.05），其中 TOX3-shRNA-3組 TOX3蛋白水平最低，與實時熒光定量PCR結果一致。因此，在后續實驗中我們選取TOX3-shRNA-3組細胞作為研究TOX3基因對乳腺癌細胞增殖活性影響的細胞模型。

圖4 轉染ZR-75-1細胞后TOX3 mRNA的相對表達

圖5 轉染后各組細胞TOX3蛋白的相對表達

圖6 干擾TOX3基因對ZR-75-1細胞增殖的影響

圖7 干擾TOX3對ZR-75-1細胞單克隆形成的影響

2.6 干擾TOX3基因對ZR-75-1細胞增殖的影響

穩定干擾TOX3基因的表達后，采用MTT實驗觀察0-7 d干擾TOX3基因對ZR-75-1細胞增殖的影響。實驗結果（圖6）顯示：與空白對照組比較，陰性對照組細胞增殖活性沒有顯著變化。與陰性對照組比較，隨著時間的推移TOX3-shRNA-3組細胞的增殖能力明顯下降。平板單克隆實驗結果（圖7）顯示，與陰性對照組比較，干擾TOX3基因后，細胞的集落形成率明顯降低，單克隆形成能力減弱。

3 討論

乳腺癌疾病已成為女性死亡的重要原因，目前尚未完全闡明其發病機制。研究認為其惡性表征相關基因的異常可能為其發病機制之一。TOX3屬于HMG家族成員之一，此家族蛋白在調控基因表達及細胞增殖分化等方面均起重要作用。近年研究發現TOX3與乳腺癌易感性相關［1］。隨后，在不同人群的GWAS研究也中進一步證實了TOX3與乳腺癌的危險性存在強烈相關性［2-14］。此外，研究發現，與ER陰性乳腺癌相比，位于TOX3基因上的多態性位點與ER陽性乳腺癌具有更強的相關性［4，15］。在ER陽性，HER2陰性乳腺癌患者中，TOX3基因的rs3803662多態性位點可作為絕經前和絕經后婦女乳腺癌患病風險的預測因子之一［16］，但TOX3基因在乳腺癌發展中的作用機制尚不清楚，相關文獻報道也較少。研究發現乳腺癌組織中TOX3蛋白的表達量明顯高于正常組織，且其表達水平與臨床TNM分期和分級具有明顯相關性［17］，在生存期較短的乳腺癌患者中，TOX3的mRNA表達水平較高，且其表達水平與乳腺癌轉移相關［18］。此外，Smid等［19］研究發現TNRC9（TOX3）基因在乳腺癌患者骨中高表達，認為TOX3可能是乳腺癌骨轉移相關基因。研究進一步發現過表達TOX3基因可促進乳腺癌細胞的侵襲和轉移，并可通過下調BRCA1的表達增強乳腺癌細胞侵襲能力；干擾TOX3基因后，成瘤率明顯降低，且形成的腫瘤也明顯減小［20］。因此，TOX3在乳腺癌的發展進程中發揮重要作用，對乳腺癌的發展可能是一個危險因素。

RNA干擾是近年用于研究特定基因功能的常用技術，其可精確沉默或敲除特定基因，對基因的抑制作用強且特異性高，為基因的功能學研究提供了有效的研究方法［21］。RNA干擾常用的表達載體主要有慢病毒、腺病毒和質粒，其中慢病毒載體能夠將目的基因高效的整合到宿主細胞的基因組內，使目的基因在傳代的過程中仍可長期穩定表達，其應用范圍較廣，轉染效率高，不產生化學轉染等方法引起的細胞損傷反應，是目前進行基因功能研究和基因治療的有力工具。研究者應用慢病毒表達載體構建穩定過表達TOX3基因的乳腺癌MDA-MB-231細胞系，結果表達GFP細胞的數目達95%以上，且轉染后MDA-MB-231細胞內TOX3的表達明顯升高［22］。在RNAi實驗中，能否抑制目的基因的表達，靶序列的設計非常重要。研究者通過設計合成3條FUT8基因的shRNA干擾靶序列，經退火，線性化連接，構建FUT8基因的RNAi慢病毒表達載體，并將其轉染到乳腺癌MCF-7細胞中，轉染效率達90%，各干擾組FUT8 mRNA和蛋白的表達均明顯降低，其中pGC-shFUT8-2 序列的干擾效率最高，且發現干擾FUT8基因后，MCF-7細胞增殖能力下降［23］。在本研究中，根據GeneBank中提供的TOX3基因序列，針對基因不同位點，按照設計原則設計合成3條shRNA靶序列，并將其連接到LV3-shRNA中，進行重組克隆，經測序驗證，序列正確，成功構建了shRNA表達載體。我們將構建好的TOX3-shRNA表達載體，經病毒包裝，采用慢病毒載體轉染自身高表達TOX3基因的人乳腺癌細胞系ZR-75-1，通過嘌呤霉素篩選后，熒光顯微鏡下觀察表達綠色熒光蛋白的細胞數目可達95%以上，獲得穩定轉染TOX3基因的細胞系ZR-75-1。通過實時熒光定量PCR和Western blot進一步驗證干擾效果，篩選出干擾效果最好的靶序列TOX3-shRNA-3，成功獲得了穩定沉默TOX3基因的乳腺癌細胞系ZR-75-1，并將其確定為后續實驗研究細胞模型。MTT實驗和平板克隆實驗初步探討干擾TOX3基因的表達對乳腺癌細胞增殖的影響。研究發現干擾TOX3可使ZR-75-1細胞的增殖能力下降，單克隆形成能力減弱，而TOX3基因的其他生物學功能及調控機制仍需進一步研究。

4 結論

本研究成功構建TOX3基因的RNAi慢病毒載體，并獲得穩定沉默TOX3基因的乳腺癌ZR-75-1細胞系，初步發現沉默TOX3后ZR-75-1細胞的增殖能力下降。