功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術的研究進展

肖冰 羅云波，2 黃昆侖，2 張園 許文濤，2

（1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083；2. 農業部農業轉基因生物安全評價（食用）重點實驗室，北京 100083）

目前待檢物質種類繁多，樣品復雜，針對不同待檢物質的定量檢測方法不一。檢測重金屬離子采用的主要方法是原子吸收法［1］、電感耦合等離子體原子發射光譜法［2］及電感耦合等離子體質譜［3］等；針對農藥、生物毒素、食品添加劑等污染物的檢測主要是采用液相色譜［4］、氣相色譜-質譜聯用等方法［5］、液相色譜-質譜聯法，各種傳統定量檢測方法可以準確測定目標檢測物的含量，但無法對不同種類的待檢物質進行統一的檢測，而功能核酸的出現與其相關技術的發展可有效地解決這一問題。功能核酸作為一類具有特定空間構象、執行特異生物功能的天然或者人工核酸序列，可以將各種待檢物質統一轉化為核酸信號再結合功能核酸相關檢測方法進行檢測。另外，還具有易于修飾、價格低廉、穩定性高及特異性強等優勢。功能核酸檢測技術分為靶標識別、信號轉換輸出兩部分。信號輸出的方式包括比色信號、熒光信號、電化學信號、化學發光信號、熱信號及動力學信號等。

其中，熒光傳感具有靈敏度高、特異性強以及可進行實時原位檢測的優勢，而標記型熒光傳感又是熒光傳感中最重要的一部分，結合功能核酸后，更擴大和增強了其檢測靈敏度、檢測范圍與檢測效率［6-7］，逐漸被廣泛應用于食品安全、環境污染、疾病診斷相關多種靶標物質的檢測［8］。功能核酸在功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術中起到的重要作用主要體現在兩個方面，一是可將多種靶物質統一轉為較為穩定的核酸信號，使現有的熒光檢測的可檢靶物質種類增多，擴大檢測范圍；二是由于功能核酸本身可擴增的性質，可以在定量檢測中加入信號擴增，使得檢測靈敏度以及檢測效率大大增強。

不同的熒光標記型材料與功能核酸結合后具有不同的發光、猝滅性質，其發光機制也不盡相同，本文針對不同熒光物質與功能核酸結合的特點將功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術分為熒光標記型線性功能核酸探針介導的熒光定量檢測技術，熒光標記型非線性功能核酸探針介導的熒光定量檢測技術，熒光標記型功能核酸雙探針介導的熒光定量檢測技術，并從這幾個角度對功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術與其實際應用進行了分類介紹與評價對比，最后討論了該技術在多種風險因子分析中的研究意義以及存在的問題，并為其未來的發展方向與應用前景作出展望。

1 功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術概述及其分類

熒光定量檢測技術是以紫外或可見光作為激發光源，照射處于基態的分子，使其吸收能量，躍遷至激發態，進而由于激發態不穩定激發態物質分子返回基態過程會散失部分能量，這部分能量轉化光能，這種光被稱為熒光，即可利用與檢測的熒光信號［9-10］。熒光定量檢測技術廣義上是由識別部分、轉化部分以及熒光物質部分構成，其檢測原理是待檢測物被識別部分與轉化部分特異性識別、結合、相互作用并轉化為可引起熒光物質敏感的信號［11］，進而導致其光物理性質發生變化，主要包括熒光的增強、淬滅和光譜位移等。

通常，在熒光標記型功能核酸介導的熒光定量檢測系統的構建過程中，需要在核酸分子上面標記熒光物質，這些用于標記的熒光物質可分為熒光素類［12-13］、羅丹明類［14-15］、氟硼類染料（BODIPY）［16］、香豆素類［17］、萘酰亞胺、芘類［18-19］、萘類［20］、蒽類及新型熒光物質等，根據檢測對象的特點選擇不同的熒光報告基團以共價鍵形式標記在核酸上，這些被熒光標記后的核酸分子作為核酸分子熒光探針在生物傳感過程中起到分子識別以及熒光信號報告等功能，根據其熒光發光特點可以將熒光標記型功能核酸介導的熒光生物傳感技術分為Light-up（點亮型）探針介導的熒光定量檢測技術、Scorpions primer（蝎子型）探針介導的熒光定量檢測技術等。

2 標記型熒光定量檢測技術幾種重要發光機制以及與核酸結合的典型應用

2.1 熒光共振能量轉移

熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）是指一個體系含有能量供體與能量受體兩個熒光團，在供體被激發后可以向受體發生能量轉移，進而受體發出熒光［21］。該機理對供體和受體的激發和發射光譜、兩者間的距離和排列方式皆有一定要求［22-23］，可應用于多種形式的熒光探針中。例如，Shamsipur等［24］基于熒光與猝滅基團的熒光共振能量轉移現象，開發了一種熒光探針介導的針對目標靶序列檢測的生物傳感器（圖1-A）。

2.2 π-π堆積激發態締合物/復合物的形成

激發態締合物（Excimer，簡稱Er）和激發態復合物（Exicplex，簡稱Ex）分別指激發態熒光基團與相同的和不同的基態熒光基團復合。激發態復合物與締合物的發射光譜與基態相比，會產生紅移，同時其發射峰呈現強而寬且無精細結構的狀態。蒽（anthracene）［25-26］和芘（pyrene）［27］等多環芳烴熒光團常用于此類探針的設計。例如，末端標有芘分子核酸發卡探針常被設計到高靈敏檢測靶標物質的熒光定量檢測技術中［28-29］。

2.3 聚集誘導發光

基于聚集誘導發光（Aggregation-Induced emission，AIE）的熒光分子是一類具有螺旋結構的分子，具有游離狀態不發熒光，聚集狀態發生較強熒光的性質［30］。具體機理是當這類分子以單體游離態被激發光激發后，被激發電子以分子內振動旋轉形式回到基態，不產生熒光；聚集時，被激發的電子無法通過分子內振動旋轉釋放能量回到基態，而通過輻射方式釋放多余能量，產生熒光。該類熒光分子可以很巧妙的結合分子溶解性來進行熒光傳感策略的設計，具有信噪比高、抗漂白能力強的特點［31］（圖 1-B）。

2.4 上轉換發光

上轉換納米材料（Upconversion luminescence，UCL）具有優異的光學性能，它能克服傳統發光材料的多種不足，尤其是其激發波長位于近紅外區，可以將低頻率激發光轉換成高頻率發射光，即吸收多個低能光子使其到達高的激發態并最終發射出一個高能光子的現象，也稱為多光子發光。以UCNPs作為標記材料可有效避免生物樣品的自體熒光和光散射，大大提高了檢測的靈敏度，UCNPs與DNA分子相結合可構建DNA熒光納米探針，在生物領域具有巨大的應用潛力［33］。2006年，Wang等［34］利用Yb3+/Er3+離子對共摻NaYF4納米晶體，并結合磁場力分離技術對靶標DNA進行檢測。

2.5 光誘導電子轉移

光誘導電子轉移（Photo-induced electron transfer，PET）［35］是指電子給體或電子受體的電荷在激發光的作用下發生電子給予或者電子接收的過程，該過程會阻礙熒光基團的電子從激發態返回基態的過程，引起熒光淬滅，若結合待檢測物質時，熒光團被氧化或還原，可以阻止光誘導電子轉移過程，使得熒光團恢復熒光，常用于熒光增強型傳感器設計，Nagano課題組就基于PET過程構建了可以識別一氧化氮及單線態氧的熒光探針（圖1-C）。

2.6 分子內電荷轉移

分子內電荷轉移，也稱作光致電荷轉移（Photoinduced charge transfer，PCT）指分子在激發光的激發下，電子在分子內部發生轉移，形成正負電荷分離的狀態［36］。熒光物質以耦合形式連接著給電子和吸電子集團，π鍵可作為電子轉移通道，其中電子所受的力越強，分子內電荷轉移效益就越強，熒光強度越強，光譜波長越長，當待檢測物分別與吸電子基團和給電子基團結合時，分別會使分子內電荷轉移效應增強和減弱，光譜波長紅移和藍移。例如，圖1-D分子探針的識別基團是其電子受體，分子中的氮雜冠醚與二甲氨基都是電子給體，冠醚和鈣離子絡合后，冠醚吸電子能力顯著變強，熒光隨之紅移。

2.7 化學發光

化學發光（Chemical emission）是指物質在進行化學反應過程中發生的一種光輻射現象。兩種可發生自發反應的物質反應后所釋放的能量激發另一類物質從基態躍遷至激發態，部分能量以輻射形式釋放出來，形成熒光。例如，圖1-E反應型汞離子分子熒光探針在溶液中與汞離子結合后其熒光強度增至34倍之多，并伴隨有光譜紅移，經檢測發現反應后可得到脫硫化合物。

3 熒光標記型線性功能核酸探針介導的熒光定量檢測技術

這類核酸鏈標記型功能核酸熒光定量檢測技術是基于標記熒光基團或猝滅基團的線性單鏈核酸探針。其原理是在靶標物質的介導下，核酸探針結構發生變化，引起熒光基團與核酸探針或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態的變化，再導致熒光信號的變化，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標物質，該類熒光定量檢測技術可分為Light-up（點亮型）探針介導型、線性單標記探針介導型與線性雙標記探針介導型等典型類型。

圖1 熒光共振能量轉移（A）聚集誘導發光（B）光誘導電子轉移（C）分子內電荷轉移（D）化學發光（E）機理圖

3.1 Light-up（點亮型）探針介導的熒光定量檢測技術

Light-up探針是一種單標記型核酸探針，可應用于定量PCR中，其特性是，游離狀態時，該類探針中不對稱花青染料噻唑橙，其中，兩個芳香族體系可以圍繞相互連接的亞甲基旋轉，物質從激發態回到基態以旋轉動能釋放多余能量，熒光微弱；芳香族部分被外力如結合另一條核酸鏈時，變為幾何平面結構，分子內無法旋轉，多余能量會以輻射能的形式釋放，轉為光能，熒光增強，該類熒光分子可以很巧妙的結合分子溶解性來進行熒光傳感策略。Svanvik等［32］報道了一種以標記有噻唑橙染料的7-9個堿基的肽核酸Light-up探針在實時定量PCR檢測中的應用，其選用的電中性核酸模擬物肽核酸比普通探針與靶DNA結合的更快更穩定，在檢測時，將體系加入到實時普通PCR體系中，每輪擴增過程后，在靶物質存在時，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競爭結合，每次退火過程后在波長是470 nm的激發光和波長為530 nm的發射光的條件下進行熒光強度的讀數，達到實時定量監測PCR過程中產生的特定擴增產物的目標（圖2-A）。

3.2 線性單標記探針介導的熒光定量檢測技術

這類核酸鏈標記型功能核酸熒光定量檢測技術的檢測原理是基于單熒光基團與單猝滅基團的熒光共振轉移原理，通過所標記的核酸結構改變或通過核酸擴增而改變淬滅基團與熒光基團的距離引起兩者間的熒光共振轉移現象的發生或停止，進而引起熒光信號的變化。Li和Lu等［37］于2000年報道了一種用于檢測鉛離子的TAMRA單標記功能核酸熒光定量檢測技術。該傳感器設計了一條5′端以共價鍵形式標有TAMRA熒光基團的20個堿基的8-17DNAzyme底物鏈（其中切割部位為一個RNA堿基）與一條3′端標有Dabcyl猝滅基團的含有34個堿基的8-17DNAzyme酶鏈，在沒有鉛離子存在以及解鏈溫度高于室溫的情況下，該條底物鏈會通過Waston-Crick鍵堿基對與其酶鏈相連，呈惰性。另外，在猝滅基團的猝滅作用下體系成低熒光狀態。環境pH為6，當鉛離子存在時，8-17DNAzyme被激活，催化切割底物鏈，使其接連溫度變低在室溫下呈不穩定狀態，進而標有熒光基團的底物鏈從酶鏈脫離，同時與標有猝滅基團的序列分離，熒光基團重新發出熒光，熒光倍數為猝滅時的3-4倍，該種熒光的激發光波長為560 nm，發射波長為580 nm。測試結果表明該種DNA傳感器的檢出限為10-8mol/L。此后，另一種鉛離子GR-5 DNAzyme也被應用于熒光定量檢測技術并顯示出更好的選擇性（圖2-B）。

3.3 線性雙標記探針介導的熒光定量檢測技術

為了提高線性標記探針介導的熒光定量生物傳感器的相關性能，研究者引入一個以上的淬滅基團建立了線性雙標記探針介導的熒光定量檢測系統，以增加傳感器的猝滅效率，降低檢測系統的熒光背景值。Lan等［38］針對鉛離子檢測，設計了一種雙標記功能核酸FAM熒光傳感器，其設計了一條5′ 端以共價鍵形式標有FAM熒光基團的含20個堿基的8-17DNAzyme底物鏈與一條3′ 端標有Dabcyl猝滅基團的含有34個堿基的8-17 DNAzyme酶鏈，并且在底物鏈的3′端加標了一個猝滅基團，以降低底物鏈未切割時的熒光背景值。該實驗的實驗條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES的緩沖液，其原理與線性單標記探針介導的熒光定量檢測技術相似，最適檢測溫度為15-25℃，檢出限為10-8mol/L（圖2-C）。

4 熒光標記型非線性功能核酸探針介導的熒光定量檢測技術

這類核酸鏈標記型功能核酸熒光定量檢測技術是基于標記熒光基團或猝滅基團的非線性單鏈核酸探針，與熒光標記型線性功能核酸介導的技術的主要區別在于體系內核酸結構的不同，呈發卡型、蝎子型等非線性形狀。其原理同樣是在靶標物質的介導下，核酸探針的結構發生變化，引起熒光基團與核酸探針或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態的變化，再導致熒光信號的改變，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標物質。該類熒光定量檢測技術包括Scorpions primer探針介導型、Amplifluor primer（引物特異型）探針介導型與Hairpin Probe（發卡探針型）介導型等典型類型。

4.1 Scorpions primer（蝎子引物型）探針介導的熒光定量檢測技術

Scorpions primer是一種在5′端標記有一段防止5′端延伸的核酸尾鏈的引物探針，這種探針可以與經過引物探針尾部延伸的同體分子靶序列互補配對，因為探針—靶物質的結合對二次退火和鏈內二級結構的支持，這種分子內部結合的速度縮短了反應過程中的平衡時間，使得信號技術十分滿足快速檢測的要求。Whitcombe等［39］利用這種蝎子型自擴增探針檢測了PCR產物，同樣，這種探針包含了由50個左右堿基，5′延伸部分，熒光猝滅分子對，以及一段自互補莖序列組成，這種蝎子型探針比普通探針與靶DNA結合的更快更穩定。在檢測時，將體系加入到實時普通PCR體系中，每輪擴增過程后，在靶物質存在時，熒光探針可與再次退火的熱變性模版競爭結合，每次退火過程后進行熒光強度的讀數，達到熒光實時定量檢測的目的。

4.2 Amplifluor primer（引物特異型）探針介導的熒光定量檢測技術

Uehara等［40］介紹了一種基于引物特異型探針的熒光共振能量轉移原理針對端粒酶閉管型檢測方法。該引物特異型探針包含了3′端和端粒重復靶序列互補配對的序列，5′端一個標有熒光基團和猝滅基團的發卡狀的41 nt長的核酸序列，發卡結構與端粒酶重復序列沒有同源部分，結構穩定。該實驗通過檢測端粒酶重復序列對端粒酶活性進行檢測，檢測時，在端粒酶具有活性時，隨著端粒酶的加入，底物序列的3′端開始30℃延伸端粒酶重復序列30 min，接著加入引物特異型序列，進行30 輪的94℃熱變性30 s和59℃的30 s PCR擴增過程，當其與端粒酶重復序列互補的序列段與端粒酶重復序列結合時，其發卡結構打開，熒光基團與猝滅基團被分離，發射熒光；當端粒酶序列不存在時，引物特異性探針內的發卡結構保持發卡狀態，熒光基團與猝滅基團發生熒光共振能量轉移，熒光被猝滅，通過對后續PCR擴增循環過程的熒光強度的監測實現對端粒酶實時監測的目標（圖2-D）。

4.3 Hairpin Probe（發卡探針型）介導的熒光定量檢測技術

為了提高標記探針介導的熒光定量生物傳感器的相關性能，研究者將檢測系統中用到的功能核酸的結構進行優化，加強底物鏈與酶鏈之間的結合率，降低檢測時的背景值。Wang和Nagraj等［41-42］將8-17 DNAzyme 酶鏈與底物鏈設計成一條發卡狀核酸鏈以加強其結合率，Wang等同時將FAM熒光基團與猝滅基團標記于核酸鏈的兩端，該段探針包含60左右個堿基，其中包含10個連續的胸腺嘧啶，檢測條件為pH為 7.2的50 mmol/L HEPES緩沖液與100 mmol/L NaCl溶液，其原理與線性單標記探針介導的熒光定量檢測技術相似，該傳感器的檢測限可達到2 nmol/L（圖 2-E，2-F）。

5 熒光標記型功能核酸雙探針介導的熒光定量檢測技術

這類核酸鏈標記型功能核酸熒光定量檢測技術是基于標記熒光基團或猝滅基團的功能核酸雙探針，該種熒光標記型功能核酸雙探針介導的熒光定量檢測技術最大的特點是在該體系中含有兩條熒光基團或者猝滅基團標記的功能核酸探針，其原理是在靶標物質的介導下，兩條核酸探針的相對狀態、結構發生變化，引起熒光基團與核酸或者熒光基團與猝滅基團間距離、狀態的變化，再導致熒光信號的變化，通過檢測這種熒光信號的變化定量檢測靶標物質，該類熒光定量檢測技術包括猝滅型雙探針介導型、熒光共振能量轉移型雙探針介導型等典型類型。

5.1 猝滅型雙探針介導的熒光定量檢測技術

猝滅型雙探針（Binary probe）介導的熒光定量檢測技術含有兩條單標記探針，基于熒光猝滅原理，兩條探針設計時可以在特定結合位點與靶序列互補配對或與靶序列進行競爭結合，當靶信號存在時，兩探針所標記的熒光信號相關物質可以發生熒光產生，熒光猝滅，熒光波長改變等熒光信號的變化，達到檢測目的。Heller 等［43］設計了一種雙探針介導的熒光定量檢測技術，他們利用兩條分別在3′端和5′端標記熒光基團和猝滅基團的可與靶序列互補配對的探針，當其與擴增后的靶序列結合時，兩段探針上的熒光基團和猝滅基團足夠靠近，發生熒光猝滅，產生熒光信號。該探針在10個堿基至10 000個堿基的區間都可以實現結合，當堿基數少于10個時，探針結合不穩定，在低于20℃時會發生解離，當堿基數大于10 000個時，結合過程時間過長（圖2-G）。

5.2 熒光共振能量轉移型雙探針介導的熒光定量檢測技術

熒光共振能量轉移型雙探針介導的熒光定量檢測技術基于熒光共振能量轉移原理，兩條探針設計時一條上邊進行能量供體標記，一條進行能量受體標記，可以在特定結合位點與靶序列互補配對或與靶序列進行競爭結合，檢測機理與上述猝滅型相似。在理想的雙探針檢測中，供體的激發光僅僅可以在靶標物質不存在時候激發供體發熒光，在靶標物質存在時，供體不發熒光僅受體發熒光，但也由于激發光的直接激發，使得該系統熒光共振能量轉移效率降低了信號/背景熒光比例，而這一問題被由Marti等［44］報道的三熒光基團探針系統有效解決，這一系統基于FAM-TAMRA-Cy5熒光共振能量轉移原理對mRNA進行檢測，這3種熒光物質的發射檢測波長分別為518 nm、581 nm和667 nm，該系統中一條探針標記著被4個堿基對隔開的FAM和TAMRA基團，第二條被 Cy5所標記，在靶標DNA存在時，FAM能且僅能與TAMRA發生熒光共振能量轉移，當探針與靶標DNA結合時，TAMRA可與Cy5發生有效的熒光共振能量轉移，結果導致產生Cy5的熒光產生以及TAMRA熒光的減少，這種原理可以有效地提高信號/背景熒光比值（圖2-H）。

6 總結與展望

功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術是一種具有高靈敏度，高特異性，甚至具有實時特性的分子檢測技術，目前在食品、臨床、環境多種檢測檢測領域具有重要的應用意義。但是，現階段仍存在一些局限性問題，如在熒光物質標記方面，部分標記型熒光物質的標記技術僅局限在特定堿基上，無法進行多種堿基的檢測與標記；有一部分具有優良發光、猝滅熒光性質的熒光物質在功能核酸上的標記技術不夠成熟，仍停留在實驗室研究，未進入產業化階段。在標記型熒光核酸傳感策略的設計方面，部分傳感策略對熒光物質和核酸結構變化的要求較為嚴格，只能實現在特定環境中對特定物質的檢測，無法實現通用型檢測；傳感性能還有待優化和完善，如熒光背景值過高、重復性不夠強、檢測時間過長等問題。因此，需要針對熒光物質、熒光傳感思路、熒光性能優化等方面進一步探索和思考，如通過對相關物質發光機制、結構特性等方面的探究，開發、合成性能更佳的熒光物質。同時，結合物質發光特點更巧妙地設計在標記型熒光傳感系統中，并優化熒光物質與功能核酸的標記方式，使其結合程度更符合我們實驗的要求；針對功能核酸標記型熒光傳感設計時，可以考慮檢測靶標物質的通用性，將原來一種熒光傳感策略設計成一類或多類的通用型傳感策略。另外，開發更高靈敏度，重復性更好的高通量實時傳感技術也是功能核酸熒光標記型定量統一化檢測技術的重要研究方向。

圖2 熒光標記型功能核酸介導的熒光定量檢測技術原理圖