化痰祛濕活血方對脂肪變L02細胞促炎抑炎因子的影響*

劉君穎 張麗慧 桑 鋒 馬慶亮 劉雪濤 趙文霞

河南中醫藥大學第一附屬醫院 (河南 鄭州， 450000)

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的患病率有逐年升高趨勢，已經成為21世紀第二大肝臟疾病[1]。NASH是向肝纖維化、肝硬化、肝癌發展的關鍵環節，其中促炎抑炎因子起到重要推動作用。有效治療NASH，控制炎性細胞因子失衡，可逆轉或延緩非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的進展[2,3]。化痰祛濕活血方是趙文霞教授近30年治療NASH的經驗方，前期臨床及動物實驗研究表明，該方能減輕肝臟炎性反應，改善肝細胞脂肪沉積，具有良好的保肝、降酶、抗纖維化作用[4，5]。通過對脂肪變細胞的研究，進一步明確化痰祛濕活血方對促炎抑炎因子的影響，探討其抗炎作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：MK3酶標儀(Thermo Fisher)，BX- 43光學顯微鏡(Olympas)、ABI7500熒光定量PCR儀(life technology公司)、TGL-16M低溫冷凍離心機(湘儀)、SW-CJ-1D單人凈化工作臺(瀘凈凈化)、HR40-Ⅱ A2生物安全柜(Haier)、SMA4000超微量分光光度計(Merinton)。

試劑：丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒(伊萊瑞特，E-BC-K235)、天門冬氨酸氨基轉氨酶(AST)檢測試劑盒(伊萊瑞特，E-BC-K236)、甘油三酯(TG)含量檢測試劑盒(索萊寶，BC0625)，肝癌壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-10ELISA試劑盒(均購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，貨號分別為 E-EL-H2306c、E-EL-H0149c、E-EL-H0102c、E-EL-H0103c)。熒光定量PCR檢測轉染主要實驗材料：引物(life technology公司合成)，BestarTMqPCR RT Kit(德國DBI，DBI-2220)，BestarTMSybrGreen qPCR mastermix(德國DBI，DBI-2043)，96孔板(美國life technology)。

1.2 中藥含藥血清的制備 化痰祛濕活血方組成：澤瀉、海藻、決明子、郁金、丹參、山楂、柴胡、水飛薊，以上藥物均由四川新綠色藥業科技發展股份有限公司提供(批號分別為13120145、14040236、14070004、14010261、14010086、1420130、14010145、14010256)。

SD雄性大鼠60只，體重(200±10)g，動物合格證號：SCXK(豫)2010-0002；動物使用許可證號：SCXK(豫)2010-0001。隨機分為化痰祛濕活血方組和空白組，每組30只。化痰祛濕活血方組大鼠按照每次0.5 ml/100 g體重灌胃化痰祛濕活血方藥煎劑2次/d，連續3 d；空白組大鼠灌服去離子水。最后一次灌胃結束后1 h，采集大鼠腹主動脈血，離心，同組大鼠的血清混合，0.22 μm濾膜過濾，滅活、分裝后儲存于-70℃冰箱中。

1.3 脂肪變肝細胞模型復制及分組 常規培養L02細胞，采用油酸復制脂肪變肝細胞模型，油紅O染色確定造模是否成功[6]。細胞分為空白組、模型組、脂聯素(ADPN)組、化痰祛濕活血方含藥血清組(簡稱中藥組)。除空白組L02細胞加入等體積量的DMSO(二甲基亞砜)外，其余各組細胞均以終濃度為40 μmol/L的油酸處理24 h造模，ADPN組細胞加入ADPN，中藥組細胞加入化痰祛濕活血方含藥血清，孵育24 h收集細胞及上清液備測。

1.4 指標檢測 ①化學發光法檢測各組細胞上清液中ALT、AST、TG含量；②采用ELISA檢測試劑盒檢測細胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 水平，嚴格按試劑盒說明書操作，根據標準曲線和OD值計算各組細胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10值。③采用熒光定量RT PCR方法檢測各組細胞中TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的表達；提取各組細胞總mRNA，測定其濃度及純度。反轉錄試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，設計并合成引物，采用熒光定量檢測試劑盒于熒光定量PCR儀上擴增，根據Ct值計算TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA的相對表達。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結果

2.1 各組L02細胞上清液中ALT、AST、TG檢測結果 見表1。

表1 各組L02細胞上清液中ACT、AST、TG結果比較

2.2 各組L02細胞上清液中炎癥因子檢測結果 見表2。

表2 各組L02細胞上清液中炎癥因子檢測結果比較

2.3 各組L02細胞TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相對表達量比較 見表3。

表3 各組L02細胞上清液中24 h TNF-α、IL-1、IL-6、IL-10 mRNA相對表達量比較

3 討論

NASH是向肝纖維化、肝硬化、乃至肝癌發展的關鍵環節，10～15年內肝硬化發生率高達15%～25%[7,8]。NASH的發生、發展與致炎因子和抗炎因子失衡有重要關系。IL具有非特異性免疫調節作用，是炎性反應中起重要作用的細胞因子。促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6等可引起炎性反應，抗炎因子IL-10具有負向調節作用。TNF-α的表達量與NASH嚴重程度呈正相關，能激活肝臟Kupffer細胞，釋放IL-6、IL-8等大量炎性因子，引發瀑布反應，促進肝細胞炎性反應及肝細胞壞死[9]。IL-1可活化多種蛋白激酶，參與肝組織纖維化過程[10]。IL-6是單核及巨噬細胞等對TNF-α、IL-1反應的產物，促進肝臟炎性損傷及纖維化。另一方面，IL-6又能反向促進巨噬細胞釋放TNF-α等，加重炎癥反應[10]。IL-6在炎癥環境中含量豐富，也是最典型的原致瘤細胞因子之一，可影響細胞增殖、存活、分化、遷移、侵襲、轉移、血管生成、炎癥和代謝。臨床研究也證實IL-6信號通路的阻斷是治療炎癥性疾病的有效方法。IL-10是一種多功能負性調節因子，具有抗炎及抗纖維化作用[12,13]。IL-10可控制免疫細胞激活，抑制促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6，改善脂質過氧化和胰島素抵抗，減少膠原生成，介入肝臟纖維化重塑。

趙文霞教授認為“痰濕內停、瘀血阻絡、肝失條達”是 NASH 發病的主要病機，因此確立了“化痰祛濕活血”的基本治則，制定化痰祛濕活血方。方中澤瀉利水滲濕，丹參活血化瘀，共為君藥；郁金行氣活血，海藻軟堅消痰，山楂消食化瘀，共為臣藥；決明子清肝利濕，水飛薊清熱舒肝，共為佐藥；柴胡疏肝解郁、引藥歸經為使藥。全方共奏化痰祛濕活血之功。前期研究證實，該方能有效改善NASH患者肝臟炎癥[14,15]，可下調NASH大鼠炎性因子TNF-α等的表達，減輕肝臟炎癥，改善肝組織脂肪變程度，抗肝纖維化[16～20]。本實驗通過復制L02脂肪變細胞模型，采用ADPN及化痰祛濕活血含藥血清進行干預，結果顯示，模型組細胞炎性反應及脂肪變程度均高于空白組，細胞及培養上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表達也明顯增加，IL-10的表達則顯著減少，這提示L02脂肪變細胞的炎性反應與上述炎性因子的表達相關。ADPN及化痰祛濕活血方含藥血清干預后，細胞及培養上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的表達也明顯降低，IL-10的表達則明顯升高，提示化痰祛濕活血方可通過調控炎癥因子表達起到改善脂肪變細胞炎癥的作用。

綜上所述，本研究從細胞因子層面探討化痰祛濕活血方治療NASH的作用機制，發現化痰祛濕活血方可能通過下調IL-1、IL-6、TNF-α以及上調IL-10表達，使脂肪變L02細胞炎性反應程度降低，從而起到防治NASH的作用，在此過程中有哪些信號通路參與尚需進一步研究。