穩定表達人源GRM4基因的乳腺癌細胞株的篩選及鑒定

林志堅 肖 斌 孫朝暉 李林海

根據2017 年發布的中國腫瘤登記年報顯示，乳腺癌的發病率已經高居全球女性惡性腫瘤之首，發病率高達28.42/10 萬，每年新發病例約27.9 萬，死亡病例數約6.5 萬[1]。

谷氨酸是重要的興奮性神經遞質之一，谷氨酸通過與谷氨酸受體結合發揮生物學作用[2]。谷氨酸受體分為離子型谷氨酸受體和代謝型谷氨酸受體兩類。代謝型谷氨酸受體包括GRM1-8共8個受體亞型，為G蛋白偶聯受體家族成員，通過介導第二信使來調節受體生理功能[3]。

代謝型谷氨酸受體4 (Glutamate Metabotropic Receptor 4，GRM4)是1種突觸前谷氨酸受體，其在控制運動的基底神經節環路的數個關鍵位置表達[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經傳遞。研究表明GRM4在結直腸癌[5]、骨肉瘤[6]等多種腫瘤中高表達并與腫瘤患者的預后相關，其過表達可能是導致惡性腫瘤發生發展的重要原因。而我們課題組近期也報道了GRM4與乳腺癌發生、發展中的生物學作用[7]。本研究擬構建人GRM4基因慢病毒載體，并篩選穩定表達GRM4蛋白的乳腺癌MDA-MB-231細胞株，為進一步探討GRM4在乳腺癌中的生物學作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

非病毒質粒3×Flag-GRM4、293T細胞系、MDA-MB-231細胞、慢病毒載體質粒、包膜質粒pMD2.G及包裝質粒psPAX2由本實驗室保存；DNA maker購自Takara公司(Cat:3427Q)；總RNA提取試劑(Cat:ER101-01)及qPCR試劑(Cat:AQ141-01)購自北京全式金公司；LipofectamineTM 2000購自Thermo Fisher(Cat:11668027)；凝膠純化試劑盒、TaqDNA聚合酶及dNTP、限制性內切酶購自Takara公司；ECL Western blotting試劑盒購自Thermo Fisher(Cat:WP20005)；DAPI染液購自碧云天(Cat:C1002)。

1.2 重組慢病毒GRM4質粒的構建和鑒定

1.2.1 目的片段獲取 以之前構建好的非病毒質粒3×Flag-GRM4為模板，進行PCR擴增，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，切膠純化后回收備用。

1.2.2 重組質粒的構建和鑒定 將PCR產物與慢病毒載體進行常規的連接、轉化、挑菌等分子克隆實驗，重組質粒并送華大基因測序鑒定。

1.3 GRM4慢病毒的包裝

轉染前一天在10 cm平皿中接種293T包裝細胞，用10%FBS的DMEM培養基；包裝細胞50%融合時共轉染質粒pMD2.G、psPAX2以及慢病毒表達載體各4 μg，以及30 μl標準的脂質體轉染試劑LipofectamineTM 2000，同時設置慢病毒空載體pCDH-vector作為陰性對照；6 h后換液，加入10 ml的新鮮培養基；48 h后培養上清用0.45 μm的非硝酸纖維濾器消毒過濾，以清除細胞碎屑及污染的包裝細胞，4 ℃暫時保存。

1.4 MDA-MB-231細胞感染、穩定株的與鑒定

感染前一天(18～24 h)，將目標細胞鋪于10 cm平皿；細胞達到50%融合度后，將10 ml的含病毒上清液加入8 μg/ml的Polybrene(已配成1000×工作液)；6 h后更換正常培養基(含10%FBS的DMEM)；24 h后開始用濃度0.5 μg/ml puro篩選；每1～2天更換培養基(均含相同puro濃度，根據細胞死亡情況，調整puro濃度)；約1周后可挑選出穩定細胞株，獲得的細胞即為穩定表達GRM4的細胞，在熒光顯微鏡下觀察各孔中GFP的熒光表達情況；將篩選后的穩定表達GRM4細胞和對照細胞按5×10個/孔接種于6孔板完全培養基中，孵育24 h后，采用Trizol法提取細胞總RNA，采用逆轉錄試劑盒將其逆轉錄成cDNA，采用RT-PCR方法檢測兩組細胞中GRM4基因表達的情況。

1.5 Western blotting檢測GRM4的表達

RIPA 裂解液提取細胞總蛋白質，按BCA蛋白質定量試劑盒說明書操作測定蛋白質濃度。蛋白質樣品進行SDS-PAGE，電轉印至PVDF膜后，用50 g/l脫脂牛奶37 ℃封閉1 h，加以50 g/L脫脂牛奶1∶1 000稀釋的抗兔Flag抗體，4 ℃過夜，TBS-T洗膜后，加以50 g/l脫脂牛奶1∶2 000稀釋的HRP標記羊抗兔抗體，37 ℃溫育1 h，TBS-T洗膜，ECL液顯影，β-actin作為內參蛋白定量。

2 結果

2.1 目的片段的獲得

以非病毒質粒3×Flag-GRM4為模板PCR擴增獲得目的基因DNA后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見大小約為2700 bp明亮特異的目的條帶，與GRM4的分子量大小相符(2736 bp)(圖1)。

圖1 PCR擴增目的基因GRM4的電泳圖

2.2 重組質粒的構建和鑒定

將重組慢病毒質粒送至華大公司測序驗證，經序列比對后證實插入序列無誤，表明重組慢病毒質粒構建成功。

2.3 重組GRM4慢病毒的包裝

GRM4慢病毒載體表達質粒和慢病毒空載體質粒pCDH-vector與包裝病毒系統質粒pMD2.G、psPAX2共同轉染293T細胞，轉染1周后收集病毒上清液。

2.4 MDA-MB-231細胞感染、穩定株的篩選及鑒定

在熒光顯微鏡下可觀察到重組GRM4慢病毒感染后的細胞和對照細胞均帶有綠色熒光，證明病毒成功感染細胞。進一步將感染過的細胞傳代，于40×顯微鏡下可觀察到轉染的細胞生長情況與正常細胞相比，細胞形態基本一致，細胞數量明顯增多，生長狀況良好；證明轉染細胞群培養成功。

2.5 RT-PCR法和Western blot法檢測感染細胞中GRM4表達

實時熒光PCR檢測結果顯示重組慢病毒感染的細胞中GRM4基因mRNA表達水平明顯高于對照組(圖2A)。Western blot 檢測結果表明，重組慢病毒感染的細胞中GRM4蛋白表達量明顯高于對照組(圖2B)。綜上所述，穩定表達GRM4的MDA-MB-231細胞株構建成功。

A為RT-PCR法檢測法，B為Western blot檢測法。

3 討論

代謝型谷氨酸受體是1個龐大的受體家族，它主要參與學習、記憶、疼痛的傳導以及維持中樞神經系統細胞內環境的穩定。這些受體被激活后通過G-蛋白效應酶、腦內第二信使等組成的信號轉導系統起作用，產生較緩慢的生理反應。有研究表明，谷氨酸信號通路的紊亂可能會導致腫瘤的發生[8]。最初，對于代謝型谷氨酸受體的研究大多集中在中樞神經系統方面。事實上，谷氨酸及其受體在外周組織中也有廣泛分布[9]，越來越多的研究發現這些受體不僅參與神經突觸的調控，還在細胞增殖、分化和生存方面發揮重要作用[10]。新近研究表明，GRM5在肝臟中具有表達，且在與肝臟相關的病理過程中發揮著重要的調節作用，GRM5的表達及活性升高可能是導致肝細胞癌變的重要原因[11]。

GRM4主要是突觸前谷氨酸受體，其在控制運動的基底神經節環路的數個關鍵位置表達[4]，參與突觸前興奮性谷氨酸信號的神經傳遞。GRM4可在人的骨肉瘤細胞中表達[6,12]，并且骨肉瘤組織中GRM4的高表達與預后不良相關[13]。此外，GRM4已經被證明與許多腫瘤的預后不良相關，如結直腸癌[5]，橫紋肌肉瘤和多發性骨髓瘤[14]。肖斌等人的研究發現GRM4能夠促進乳腺癌細胞的增殖能力[7]。根據GRM4的前期研究報道及代謝型谷氨酸受體各亞型在多種腫瘤進程中的作用，我們推測GRM4可能在乳腺癌發生發展過程中發揮重要作用。

細胞基因轉染有多種載體可供選擇，如質粒、脂質體、反轉錄病毒和腺病毒等，其中慢病毒載體以其高感染率、高效整合、高效轉錄、高效表達、宿主范圍廣及安全性好等特點，已成為真核系統基因轉移的有力工具。本研究通過基因重組技術將GRM4基因插入到慢病毒載體中，構建了重組慢病毒載體質粒。隨后，將構建好的重組質粒與病毒包裝質粒同時轉染到239T細胞中，進行病毒包裝。用重組慢病毒感染MDA-MB-231細胞，經藥物篩選和實驗鑒定后，成功獲得穩定表達GRM4蛋白的細胞株。穩定表達GRM4蛋白的人乳腺癌MDA-MB-231細胞株的獲得，可作為GRM4 蛋白過表達載體應用于腫瘤等疾病的功能研究，有助于從細胞和分子水平深入探討GRM4 蛋白在乳腺癌細胞的發生發展過程中的作用機制。