芪三酚對糖尿病白內障模型大鼠體質量和生化指標的影響

邢 進，胡水清

作者單位:(121000)中國遼寧省錦州市，錦州醫科大學附屬第三醫院眼科

0 引言

近年來隨著生活水平的提高，人們越來越多的不良飲食結構、生活習慣和社會人口的老齡化致使糖尿病的發病率逐年升高，糖尿病最常見的并發癥之一就是白內障［1］。糖尿病白內障是我國排名第2位的致盲眼病，僅次于視網膜病變，每年白內障患者都在以幾十萬的數目累積增加，大部分白內障都是由于糖尿病而引起的，發病原因復雜，氧化性損傷和晶狀體上皮細胞的凋亡在其中發揮了重要作用［2］。芪三酚又被稱為白藜蘆醇，是一種非黃酮類的多酚化合物，具有強大的抗氧化、抗炎功能和清除自由基的功能［3］。體質量和血糖水平是檢測糖尿病的重要指標，糖尿病患者在患病后體質量會下降，血糖升高［4］。本研究通過使用芪三酚對糖尿病白內障模型大鼠進行干預，對大鼠體質量、血糖指標和肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇進行觀察，探究芪三酚對糖尿病白內障進展的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料 選取SD健康大鼠30只，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。其中雌性大鼠16只，雄性大鼠14只，年齡 7～10(平均 8.4±0.3)周齡，體質量為210～240(230.6±23.4)g，飼養溫度為22℃～25℃，室內濕度35%～40%，飼養室定時進行紫外線照射消毒。統一喂給標準飼料，允許自由活動，飼養時間為1wk，符合動物保護條例。本研究獲得我院醫學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 建模處理 將大鼠隨機分成三組，每組各10只，分別為空白組、模型組和治療組。空白組大鼠常規飼養，模型組和治療組大鼠進行建模處理(糖尿病白內障模型)，根據大鼠的體質量按照50mg/kg腹腔內注射經0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液稀釋后的鏈脲霉素溶液，在對大鼠注射3d后取大鼠尾部靜脈血檢查大鼠的空腹血糖值，當大鼠的空腹血糖值＞14mmol/L時則表示建模成功，空白組大鼠建模期間注射等體積生理鹽水。從建模成功第1d開始，對治療組大鼠按照100mg/kg給予芪三酚灌胃處理，每天1次［5］，空白組和模型組大鼠不做干預，5wk后觀察三組大鼠具體情況。

1.2.2 晶狀體檢查 在注射干預5wk后，分別將三組大鼠使用復方托吡卡胺滴眼液進行散瞳，10min后手持裂隙燈顯微鏡下觀察大鼠左眼晶狀體混濁情況。晶狀體透明沒有混濁的為0級，記為0分;晶狀體輕度混濁，周邊有空泡，核分界明顯的為Ⅰ級，記為1分;晶狀體呈現中度混濁，且周圍的空泡向中間聚集的為Ⅱ級，記為2分;晶狀體高度混濁并且周圍的空泡已經聚集到核區使核區呈現霧狀混濁的為Ⅲ級，記為3分;晶狀體中核完全混濁沒有界限的為Ⅳ級，記為4分，是成熟的白內障。根據各組大鼠白內障的評分情況乘以相應個數，得出各組白內障大鼠整體評分后進行統計比較。

1.2.3 體質量稱重 分別于第3、5wk將三組大鼠注射麻醉藥進行麻醉后，放置于電子秤上對大鼠進行稱重，取平均值，單位為克(g)。將大鼠放置于桌面，使其身體呈伸直狀態并背面朝上，使用尺子從大鼠頭部量至尾部根部，其長度為大鼠身長，單位為厘米(cm)。

1.2.4 血糖水平檢測 分別于建模后第3、5wk，在三組大鼠餐前空腹時和餐后2h在尾端用75%酒精消毒后針刺取血，將待測血樣加入肝素抗凝試管中，使用葡萄糖氧化酶法對三組大鼠空腹血糖(FPG)和餐后2h血糖(2hPG)進行檢測，嚴格按照自動分析儀操作說明書進行。

1.2.5 酶聯免疫吸附測定肌酐、尿素氮 取三組大鼠第5wk采集的血樣，采用50mmol/L碳酸鹽包被緩沖液將抗原進行溶解，濃度為10～20μg/mL，在96孔酶標板中加入100μL/孔，4℃過夜保存。第2d舍棄包被液，采用 PBST洗滌3次，每孔中加入150μL 1%BSA，在37℃環境中封閉1h。之后采用PBST洗滌3次，在每孔中加入100μL不同倍比稀釋度的血清，加入對照樣品，37℃孵育2h。采用PBST洗滌5次，加入100μL稀釋后的HRP標記的二抗，37℃孵育1h。PBST洗滌5次后，使用顯色劑顯色20min后，在酶標儀上讀取A405吸收值，從而測定肌酐、尿素氮的表達水平。

1.2.6 化學發光分析法檢測甘油三酯和總膽固醇表達水平 取三組大鼠第5wk采集的血樣，待測標本加入化學發光物質，與催化劑發生催化反應，與氧化劑發生氧化反應，形成處于激發狀態的中間體，當中間體達到穩定時，會發射出光子，嚴格按照化學發光分析儀操作步驟，利用發光信號測量儀測量光子數值，對比分析甘油三酯、總膽固醇表達水平。

1.2.7 切片處理 三組大鼠在干預5wk后采用斷頭法處死，摘除右眼眼球，在平衡液下沖吸，取出完整晶狀體，并盡量將周圍虹膜、玻璃體和懸韌帶等組織去除，制作石蠟切片。先置于4%多聚甲醛中固定，然后取出用PBS緩沖液沖洗，放入緩沖液中浸泡洗滌，10h后吸干周圍水分，使用梯度酒精脫水處理后再用二甲苯透明處理30min，最后浸蠟和常規石蠟包埋。

1.2.8 HE染色處理 對三組大鼠切片樣本進行染色處理，使用二甲苯進行常規脫蠟處理2次，每次5min，然后在梯度酒精下水化處理3min，自來水沖洗1次;使用蘇木素染色5min，自來水沖洗1次;使用1%鹽酸酒精分化處理30s，在0.2%氨水中返藍處理2min，自來水沖洗1次;0.5%伊紅染色10min，自來水沖洗1次;使用乙醇進行梯度脫水處理，最后用中性樹膠進行封片，使用光學顯微鏡進行圖像分析。

統計學分析:采用SPSS19.0統計軟件包進行統計分析處理。計量資料采用均數±標準差(珋x±s)描述，三組間比較采用單因素方差分析，不同時間點的比較采用配對樣本t檢驗;計數資料采用例數和百分比進行描述。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠晶狀體情況 空白組大鼠晶狀體透明，未見混濁;模型組大鼠在散瞳后晶狀體呈現白色混濁，皮質與核融為一體無界限;治療組大鼠有部分晶狀體的皮質呈現不規則乳白色的絮狀混濁，晶狀體核尚呈透明狀(圖1)。

2.2 三組大鼠晶狀體病理組織學觀察 空白組大鼠晶狀體上皮細胞分布均勻、形態規則，晶狀體囊膜和相鄰細胞結合緊密，晶狀體纖維細胞沒有異常表現;模型組大鼠晶狀體上皮細胞形態不規則、分布不均勻，胞質疏松，細胞核縮小，核內染色質濃縮、不均勻;治療組大鼠晶狀體上皮細胞相比模型組大鼠上皮細胞排列較為緊密，胞質中空泡個數少于模型組大鼠(圖2)。

2.3 三組大鼠晶狀體混濁程度比較 空白組大鼠晶狀體透明，無混濁現象;治療組大鼠晶狀體混濁程度和白內障整體評分均顯著優于模型組大鼠(表1)。

2.4 三組大鼠體質量和身長的比較 空白組、治療組大鼠第5wk的體質量顯著高于第3wk，模型組大鼠第5wk的體質量顯著低于第3wk，差異有統計學意義(t=26.71、17.28、17.01，均P＜0.001);三組大鼠第5wk的身長明顯長于第3wk的身長，差異有統計學意義(t=7.79、2.94、5.67，均P＜0.05);治療組大鼠治療第3、5wk時的體質量與身長明顯高于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0.05，表 2)。

2.5 三組大鼠血糖水平的變化 模型組大鼠第5wk的FPG、2hPG水平顯著高于第3wk，差異有統計學意義(t=3.85、4.35，均 P＜0.001);治療組大鼠第 5wk 的 FPG、2hPG水平顯著低于第3wk，差異有統計學意義(t=14.26、7.30，均P＜0.001);治療組大鼠第3、5wk時的FPG、2hPG水平明顯低于模型組大鼠，差異有統計學意義(P＜0.05，表3)。

圖1 三組大鼠晶狀體情況 A:空白組;B:模型組;C:治療組。

圖2 三組大鼠晶狀體病理組織學觀察(HE×100) A:空白組;B:模型組;C:治療組。

表1 三組大鼠處理5wk 后晶狀體混濁程度和整體評分比較

表2 三組大鼠體質量和身長的變化x珋±s

表3 三組大鼠血糖水平的變化(，mmol/L)

表3 三組大鼠血糖水平的變化(，mmol/L)

注:空白組:不做處理;模型組:進行糖尿病白內障模型處理;治療組:糖尿病白內障模型+芪三酚處理。aP＜0.05 vs空白組;cP＜0.05 vs模型組。

組別 只數 FPG 2hPG第3wk 第5wk 第3wk 第5wk空白組 10 3.72±0.48 3.43±0.76 7.17±1.26 7.24±1.27模型組 10 15.46±1.12a 20.27±3.79a 24.37±2.14a 29.58±3.12a治療組 10 10.47±0.65a，c 5.61±0.86a，c 15.24±1.89a，c 10.25±1.05a，c F 12.19 11.93 10.11 18.57 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.6 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化 第5wk時，模型組和治療組的尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平相比空白組都有明顯上升，肌酐表達水平相比空白組有明顯下降，其中治療組的尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平相比模型組有明顯下降，肌酐水平相比模型組有明顯上升，差異有統計學意義(P＜0.05，表4)。

表4 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化

表4 三組大鼠肌酐、尿素氮、甘油三酯和總膽固醇水平的變化

注:空白組:不做處理;模型組:進行糖尿病白內障模型處理;治療組:糖尿病白內障模型+芪三酚處理。aP＜0.05 vs空白組;cP＜0.05 vs模型組。

組別 只數 肌酐(c/μmol·L－1) 尿素氮(c/mmol·L－1) 甘油三酯(c/mmol·L－1) 總膽固醇(c/mmol·L－1)空白組 10 39.42±4.34 6.69±1.10 0.97±0.65 2.15±0.20模型組 10 22.63±2.20a 19.92±3.03a 1.78±1.22a 2.76±0.25a治療組 10 30.79±3.75a，c 17.39±1.18a，c 1.02±1.09a，c 2.34±0.20a，c F 5.94 2.48 1.47 4.15 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

白內障是一種常見眼部并發癥，主要由糖尿病引起，以老年患者為主［6］。有研究表明，糖尿病白內障多是受醛糖還原酶影響，當細胞內山梨醇堆積后，就會引起滲透壓的變化，眼內部的房水滲透壓增高，從而使得晶狀體內部的纖維水腫，進而產生斷裂或崩裂現象，晶狀體逐漸退化，最終晶狀體混濁，從而形成糖尿病白內障［7－8］。本研究選取健康SD大鼠進行糖尿病白內障模型的建造，然后對糖尿病白內障大鼠使用芪三酚進行干預，通過檢測大鼠的各項指標，判斷芪三酚用于糖尿病白內障治療的效果。

芪三酚也稱白藜蘆醇，是一種能夠產生自身抗逆性的非黃酮類多酚化合物，同時也是一種重要抗毒素，存在于多種植物中，具有調節血脂、抗腫瘤、抗低密度脂蛋白氧化、抗病毒等多種作用［9－10］。同時芪三酚還具有強大的抗炎與清除活性氧自由基的能力，能夠維持晶狀體的氧化還原程度［11］。糖尿病引起的白內障的晶狀體上皮細胞密度會明顯低于正常的白內障晶狀體上皮細胞密度，并且前后囊膜混濁的程度也明顯高于正常的白內障前后囊膜混濁程度［12－13］。本研究發現，白內障大鼠晶狀體給藥治療后有部分晶狀體的皮質呈現不規則乳白色的絮狀混濁，晶狀體核尚呈透明狀，并且發現其晶狀體混濁程度多數在Ⅰ級或Ⅱ級、Ⅲ級，說明芪三酚對晶狀體的混濁程度有著明顯的改善作用，能夠有效緩解白內障。與李青春等［10］研究保持一致。芪三酚在降低血糖的同時促進機體營養素的吸收［14］，本研究結果顯示，芪三酚灌注的大鼠體質量和身長增加，說明芪三酚能夠改善大鼠體質量，促進其恢復。

糖尿病白內障不僅會使機體內的血糖水平產生異常，還可能會出現肝腎功能的損壞［15］。本研究結果顯示，糖尿病白內障大鼠FPG與2hPG檢測水平明顯上升，芪三酚干預后，FPG與2hPG水平顯著降低，且隨著時間的推移，下降趨勢更加明顯，說明芪三酚對于糖尿病性白內障確有降低血糖的作用。張劍等［16］研究也指出，芪三酚能夠改善大鼠血糖水平，本研究結果與其保持一致，說明芪三酚能夠達到與其相同的治療效果。肌酐和尿素氮是檢測腎功能的重要指標，血清肌酐一般認為是人體肌肉代謝的產物［17］。維持人體內基礎物質的蛋白質會被葡萄糖燃燒掉，其他營養素被轉化成為蛋白質之后又會被葡萄糖燃燒后排出體外，尿素氮是血漿中除了蛋白質之外的另一種含氮化合物，是人體蛋白質代謝的最終產物［11］。甘油三酯和總膽固醇的升高說明血脂升高，甘油三酯可以促進肝臟糖原的合成，加重糖尿病［18］。根據本研究，對大鼠進行芪三酚灌注治療后，血清肌酐水平有所上升，尿素氮、甘油三酯和總膽固醇的表達水平有所下降，說明芪三酚可以使機體內有關血糖和腎功能的指標恢復。

綜上所述，芪三酚能夠改善糖尿病白內障大鼠晶狀體的混濁程度，減輕疾病對大鼠體質量的影響，控制大鼠血糖水平以及肌酐、尿素氮、甘油三酯、總膽固醇等生化指標水平，從而緩解白內障的進展程度，為臨床中糖尿病白內障的治療提供了重要的理論依據。