復蘇后常溫條件下卵巢組織活性與時間關系的初步探究

金鳳羽 阮祥燕,2* Alfred O. Mueck，2 杜 娟 李揚璐 程姣姣 王虎生

(1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院內分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學婦產醫院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國)

隨著人類醫學的進步和腫瘤治療學的發展，腫瘤患者的5年生存率有了很大的提高，年輕癌癥患者的5年生存率高達83%左右[1]。這些患者在腫瘤病痛緩解或治愈之后卻又常常面臨另外一個嚴峻的問題，在接受細胞毒性抗癌化學藥物治療或放射治療之后生育能力往往受到嚴重破壞，致使生活質量受到很大影響，甚至不孕，家庭婚姻關系因此破裂者不在少數。因此，對這些女性患者，尤其是青春期前的進行生殖力保護是非常重要和必要的。根據中國和德國婦產科協會(German Society of Gynecology and Obstetrics，DGGG)[2]在2018公布的指南，所有年輕惡性腫瘤患者應同時接受腫瘤學家和生殖力保護專家的咨詢。

卵巢組織冷凍保存是保護女性生育能力的重要方法之一，是青春期前女孩或需要立即治療的患者的唯一可行選擇[3-4]。到2018年1月，根據報道[4]通過該項技術累計共有130多個嬰兒出生，且該數量呈幾何式上升。因此，Lambertini等[5]認為卵巢組織凍存技術能夠很好地保護女性生殖力，因此不應該再停留在實驗室階段而是廣泛應用于臨床。

為了進一步完善這種新型技術，提高臨床妊娠率，在凍存技術本身以及手術方面等方面展開了相關研究[6-8]，包括冷凍保存程序、凍存保護劑以及移植部位，然而卵巢組織復蘇后轉運條件的研究鮮有報道。鑒于這種情況，本研究的主要目的是通過對復蘇后常溫情況下存放不同時間的卵巢組織進行活性檢測，借此評估復蘇后的時間推移是否影響卵巢組織的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

就診于首都醫科大學附屬北京婦產醫院，需要手術治療的卵巢腫瘤患者或需要進行卵巢組織凍存以保護生殖力的患者共13名，經患者知情同意后，腹腔鏡下冷刀取部分卵巢組織，置于康斯特保護液中(4 ℃)迅速轉運到首都醫科大學北京婦產科醫院卵巢庫實驗室。本研究經首都醫科大學附屬北京婦產醫院倫理委員會審批，倫理審批號：2017-KY-020-1。在實驗室中，去除卵巢組織的髓質和血管，僅保留皮質部分，最后將卵巢組織制作成為直徑2 mm，厚度1 mm的圓形標本，其中生殖力保護患者用于研究的卵巢組織不得超過取材總量的10%。每位患者共取標本9個，采用數字表法隨機將其中1個新鮮標本進行卵泡計數，剩余的8個標本進行程序化冷凍。液氮中保存至少1周后進行復蘇，復蘇后按照常溫存放時間的不同分為4組，即組1(0 min)、組2(20 min)、組3(40 min)和組4(60 min)，每組2個標本，置入含有培養液的24孔板中進行獨立培養。4 d后收集培養液進行雌激素、乳酸以及葡萄糖代謝濃度測定，卵巢組織標本進行卵泡計數。

1.2 程序化冷凍、復蘇培養

凍存液是由Leibovitz’s L-15(Gibco公司，美國)、1%(體積分數)人血清白蛋白(IrvineScience公司，美國)和10%(體積分數)CryoSure-DMSO(WAK-Chemie Medical GmbH)按照比例配置而成。卵巢組織標本制作完成后，每2個標本放入含有1.5 mL凍存液的無菌凍存管內進行程序化冷凍。冷凍程序參照文獻[9]。首先，將卵巢組織置入4 ℃凍存液中平衡15 min。然后將含有卵巢組織的無菌凍存管轉移到程序冷凍儀內進行程序化冷凍(PLANER，GDKRYO360CH-1.7-230)。降溫速度：在最初的5 min內，降溫速度為2 ℃/min，待凍存管溫度降至-6 ℃時進行人工誘導冰晶形成。然后按照0.5 ℃/min的速度繼續降溫至溫度達到-40 ℃，最后按照50 ℃/min的速度迅速降至-140 ℃。冷凍完成后將無菌凍存管轉移至-196 ℃液氮儲罐中儲存，7 d以后進行復蘇。

復蘇液由9 mL DPBS(Gibco公司，美國)和1 mL人血白蛋白(IrvineScience公司，美國)組成。復蘇時對每位患者的8個標本同時進行復蘇。復蘇過程：①取出儲存在液氮罐內的凍存管，置于37 ℃的水浴箱中2 min。②從凍存管內取出卵巢組織標本，依次轉移到6孔板中進行洗滌、平衡。前3孔每孔內含復蘇液10 mL，蔗糖含量分別為(0.75、0.45、0.125 mol/L)，每隔15 min將卵巢組織標本轉移至下一個孔內，共3次。第4孔和第5孔內僅含復蘇液，不包含蔗糖。卵巢組織在第4孔內平衡10 min后轉移至第5孔內繼續平衡。5 min后復蘇完成。

在復蘇完成后的第0、20、40、60 min時采用數字表法隨機選取2個卵巢組織標本轉移至含有1 mL培養液的24孔板內進行獨立培養。培養液由90%(體積分數)DMEM(4.5 g/L D-glucose)和10%(體積分數)人血白蛋白按照比例配置而成。培養箱溫度37 ℃，5%(體積分數)CO2，95%濕度。4 d后收集培養液測定其中雌激素、孕激素、乳酸的濃度，卵巢組織進行卵泡計數。

1.3 卵泡計數及雌激素、乳酸和葡萄糖測定

由于鈣黃素AM(calcein AM)只能在活細胞中才能被轉化為熒光鈣黃素，并產生熒光綠色染色。因此，本研究采用Calcein AM(美國Sigma公司)對卵巢組織進行染色后在495 nm熒光顯微鏡下觀察，對所有活性卵泡進行計數。

本研究采用酶聯免疫吸附法測定培養液內的雌激素的濃度，采用比色法/吸收法測定乳酸以及葡萄糖濃度。雌激素測定試劑盒購自德國DRG公司，乳酸及葡萄糖測定試劑盒購自美國Biovision公司。

1.4 統計學方法

本研究采用SPSS 17.0統計學軟件對實驗數據進行統計學分析。就卵泡計數而言，新鮮卵巢組織組和復蘇后第0分鐘(組1)兩組之間的差異采用兩個獨立樣本的t檢驗或t’檢驗。為了確定時間變化是否會對卵泡活性以及卵巢組織整體活性產生影響，對復蘇后不同時間點4組的卵泡計數，雌激素、乳酸濃度和葡萄糖分別進行了重復測量設計的方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料

收集2014年至2017年期間就診于首都醫科大學附屬北京婦產醫院的13名育齡期女性的卵巢組織，這些女性患有卵巢良性囊腫需要腹腔鏡手術治療或需進行卵巢組織凍存。所有患者月經規律，平均年齡(34±5.4)歲，其中宮頸癌9例，乳腺癌1例，卵巢囊腫1例。

2.2 卵泡計數比較

新鮮卵巢組織組和組1(復蘇后第0分鐘)的活性卵泡平均數為33.360±45.857和30.680±32.884。兩組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。復蘇后不同時間點(復蘇后第0，20，40，60分鐘)卵泡計數無明顯下降，4組間進行重復方差分析，差異無統計學意義(P>0.05)(圖1)。

2.3 4組雌激素濃度比較

復蘇后4組培養液內的雌激素平均濃度分別為5.231±0.637,5.121±0.734,5.042±0.991和5.895±1.106(pg/mL)，4組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1。

圖1 復蘇不同時間點熒光顯微鏡下及光學顯微鏡下卵泡(100×)Fig.1 Follicles at different time points after thawing under fluorescence and optical microscopy

ItemNumberofcaseGroup1Group2Group3Group4FPEstrogen/(pg·mL-1)135.231±0.6375.121±0.7345.042±0.9915.895±1.1060.8920.356Lactate/(mmol·L-1)133.931±8.6273.581±9.1043.265±0.4983.087±0.5560.2290.638Glucose/(ng·mL-1)1315.575±1.02016.040±1.35917.037±6.04218.081±9.1331.7590.220

Group1:0 min;Group2:20 min；Group3:40 min；Group4:60 min.

2.4 4組乳酸濃度比較

復蘇后隨著時間的推移，培養液內的乳酸濃度呈下降趨勢，組1乳酸濃度最高為(3.931±8.627)mmol/L，組4最低為(3.087±0.556)mmol/L。但這4組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1，圖2。

2.5 4組葡萄糖濃度比較

培養液內的葡萄糖濃度呈上升趨勢，組1葡萄糖濃度最低為(15.575±1.020)ng/mL，組4最高為(18.081±9.133)ng/mL，然而這種上升趨勢差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表1，圖3。

3 討論

卵巢組織凍存為青春期前女性以及迫切需要進行放射治療聯合化學藥物治療(以下簡稱放化療)的育齡期女性提供了保留生殖力的希望。但是由于這項技術從實驗室走向臨床的時間僅僅數十年，仍需要大量的相關研究和數據進一步優化，這不僅包括了最重要也是爭議最多的凍存方案，同時也應該包括卵巢組織取材、卵巢組織凍存、卵巢組織復蘇以及卵巢組織再移植等所有環節中的可能影響因素，例如復蘇后的轉運條件以及轉運時間限制。然而截止到目前，卵巢組織凍存技術相關研究多數集中在凍存方案和凍存保護液方面，其他影響因素鮮有報道，亟待更多相關研究。

圖2 復蘇后4組乳酸濃度隨時間變化趨勢Fig.2 Trend of lactate levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

圖3 復蘇后4組葡萄糖濃度Fig.3 Trend of glucose levels with time after thawing

Group1:0 min after thawing;Group2:20 min after thawing;Group3:40 min after thawing;Group4:60 min after thawing.

由于程序化卵巢組織凍存技術對實驗室設備和相關技術人員有一定水平的要求，因此在歐洲建議采取中心化管理模式[5]，其他一些地區的女性可以通過冷鏈等方式將卵巢組織轉運到那些具有條件的醫院和實驗室進行卵巢組織凍存，而復蘇后則要求盡快將卵巢組織移至體內，實驗室和手術室需要近在咫尺，大大限制了這項技術的推廣。此外，手術本身是一件隨時可能意外的發生，如果卵巢組織如期復蘇完畢，而因為腹腔內大量粘連、出血等因素導致移植部位不能在預期的時間內完成準備工作，可能會患者造成不可逆的損失。因此為了避免上述情況的發生，臨床工作中往往會選擇在確認患者移植部位已經準備完畢后再啟動復蘇程序(整個復蘇過程至少1 h以上)，不可避免地延長了手術時間，增加了患者的負擔。然而該研究發現復蘇后在常溫條件下，卵巢組織在1 h內活性卵泡個數以及卵巢組織整體活性并沒有出現明顯下降，因此嚴格地等待患者移植部位手術準備完畢再啟動復蘇程序很可能是不必要的。

卵泡計數是反應卵巢組織活性的一個非常重要的指標，本研究中在新鮮組和復蘇后組1(復蘇后第0分鐘)之間，復蘇后4組間卵泡計數差異均無統計學意義。然而卵泡計數評估卵巢組織活性存在著一定的缺陷，卵泡只有在嚴重受損后幾小時才會出現組織改變并能被現有得檢測技術所檢測出來[9]，因此卵泡計數以及完整性并不能完全地反映組織真正的受損情況，仍需要結合其他指標進行評估卵巢組織整體活性[10-12]。雌激素是由活性卵泡分泌產生的一種類固醇激素，通過測定培養液內雌激素的濃度可以在很大程度上反映出組織中卵泡的活性情況，從而彌補單純卵泡計數評價卵巢組織活性的不足[11]。乳酸以及葡萄糖代謝的測定可以用于評估復蘇后卵巢組織整體活性情況，乳酸濃度越低提示卵巢組織活性下降越嚴重。反之，葡萄糖濃度越高提示組織對葡萄糖的攝取越少，意味著組織活性越差[13]。在本研究中，對復蘇后4組培養液內的雌激素、乳酸以及葡萄糖濃度進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)，均提示復蘇后的卵巢組織在短時間內無論是卵泡計數還是組織整體活性情況都沒有發生明顯下降。但由于受樣本量的限制，本項研究僅對復蘇后1 h內的卵巢組織活性進行評估，沒有發現明顯下降。然而復蘇后等待時間繼續延長，卵巢組織的活性是否會下降尚無可預知，仍需進一步研究。此外，本研究僅對能卵巢組織活性的幾個重要指標進行了觀測，是否會影響再移植卵巢組織存活仍需臨床進一步驗證。復蘇后常溫條件下卵巢組織在1 h內卵泡計數無顯著性減少，卵巢組織整體活性無顯著性下降。