糖化白蛋白調控腎損傷相關分子與Toll樣受體信號通路及齊墩果酸對其干預作用的研究

段 楠 黃辰煒 逄 璐 李海霞

(北京大學第一醫院檢驗科，北京 100034)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的微血管合并癥之一，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)的最常見病因，最終引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)和過早死亡[1-2]。持續高血糖環境所形成的晚期糖基化終產物(advanced glycation end products，AGEs)可能造成糖尿病腎臟損傷，糖化白蛋白(glycated albumin，GA)是AGEs前體之一，目前在臨床上是反映近2～3周平均血漿葡萄糖濃度的有效指標。本課題組前期研究[3]顯示，GA能夠上調腎小管損傷相關分子的表達，并促進炎性細胞因子的分泌從而對腎小管造成損傷。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路與炎性反應相關，參與糖尿病等非感染性炎性疾病的發生發展，而GA對其的影響尚不明確。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種天然五環三萜類化合物，近年來發現其具有降糖及改善DM的作用[4]，其能否降低GA介導的腎小管損傷也不清楚。本研究擬用GA和OA處理人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞系)，觀察腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和中性粒細胞明膠酶相關載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)腎損傷相關分子水平，并探討GA和OA對Toll樣受體信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

糖化白蛋白、齊墩果酸(Sigma公司，美國)，人晚期糖基化終產物受體(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)抗體(R&D公司，美國)，DMEM F-12培養基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)，青霉素、鏈霉素和兩性霉素B(Lonza公司，美國)，胰蛋白酶消化液(Gibco公司，美國)，Trizol、cDNA反轉錄試劑盒、SYBR?GreenPCR熒光染料(Invitrogen公司，美國)，人類KIM-1和NGAL ELISA試劑盒(R&D公司，美國)，兔源性抗p38 MAPK抗體、抗IRAK4抗體、抗TLR1抗體、抗TLR2抗體、抗TLR7抗體及抗TLR9抗體(Cell Signaling Technology公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶科技有限公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

實驗使用人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞系，購自美國標準培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細胞培養于含有10%(體積分數)胎牛血清，1×10 000 U/L青霉素、10 000 μg/L鏈霉素及20 μg/L兩性霉素B的DMEM-F12培養基中傳代培養，培養于37 ℃、5%(體積分數)CO2的飽和濕度空氣培養箱。倒置顯微鏡下觀察形態，3 d左右HK-2細胞生長融合成單層細胞，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。

1.2.2 細胞分組與刺激

取生長良好的HK-2細胞接種于六孔板，待細胞生長至視野70%～80%匯合時，使用無血清DMEM-F12培養基同步化12 h，采用數字表法隨機分成對照組與實驗組, 刺激濃度參考課題組前期研究[3]與預實驗結果：(1)空白對照組：無刺激；(2)人GA組：0.5 mg/mL GA[3]；(3)GA+抗RAGE抗體組：0.5 mg/mL GA[3]，10 μg/mL RAGE抗體(依據R&D試劑說明書，當濃度達10 μg/ mL時，該抗體能夠阻斷>90%的受體-配體結合)；(4)GA+OA組：0.5 mg/mL GA[3]，80 μmol/mL OA(預實驗提示的最小有效濃度)。對以上各組細胞分別進行24 h刺激，每組實驗重復3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR測定細胞中KIM-1與NGAL mRNA

按照Trizol說明書提取各組細胞總RNA，以2 μg總RNA按照反轉錄試劑盒說明書反轉錄獲得cDNA，在ABI 7500儀器(Life Tech公司, 美國)進行熒光實時定量PCR(real-time PCR)。總反應體積20 μL，反應條件：預變性95 ℃10 min，變性95 ℃ 15 s及退火60 ℃ 60 s(共40個循環)。引物設計使用Primer Premier 3.0，由生工(上海)公司合成，稀釋為 10 μmol/L工作液，序列見表1。每次3個復孔，每個實驗重復3次。目的基因mRNA Ct 值用GAPDH Ct值校正。根據所得Ct值，運用2-ΔΔCT相對定量法計算內參、目的基因的相對表達量。

1.2.4 ELISA法測定培養上清液中KIM-1與NGAL

各組細胞在相應物質處理后，分別收集上清液。按照說明書進行ELISA反應，各步驟結束后30 min內使用酶標儀于450 nm波長處讀取每孔吸光度值，根據吸光度值與倍比稀釋濃度建立KIM-1和NGAL濃度的標準曲線，樣品中KIM-1和NGAL濃度從標準曲線讀取。

1.2.5 實時熒光定量PCR測定細胞中Toll樣受體信號通路傳導的表達

細胞RNA的提取、cDNA的制備以及Real-time PCR的具體操作步驟詳見上述的“1.2.3”。Toll樣受體信號通路中關鍵激酶p38 MAPK與IRAK4，以及TLR1、TLR2、TLR7和TLR9的引物設計使用Primer Express 3.0，結果與Pub-Med BLAST比對，引物由生工(上海)公司合成，稀釋為10 μmol/L工作液，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blotting法檢測細胞中Toll樣受體信號通路蛋白的表達

提取各組HK-2蛋白后采用BCA試劑盒對蛋白質定量分析后，取總量相等的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法電泳，轉膜后5%(質量分數)脫脂奶粉非特異性封閉1.5 h。加入一抗(1∶500)，4 ℃過夜。以HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)室溫避光孵育1 h，ECL超敏發光液孵育1 min，將膜放入凝膠成像分析系統中顯影。用Image J 1.52版軟件分析待測蛋白條帶灰度與作為內參的GAPDH蛋白條帶灰度的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 GA與OA對HK-2細胞KIM-1和NGAL mRNA表達的影響

相對于空白對照組，GA組細胞KIM-1和NGAL的mRNA表達均出現顯著性上升(P<0.05)，而GA+抗RAGE抗體、GA+OA兩組的細胞無顯著性變化。并且，GA+抗RAGE抗體組、GA+OA組細胞中KIM-1和NGAL的mRNA表達顯著低于GA組(P<0.05)；GA+OA組與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統計學意義(圖1)。

2.2 GA與OA對HK-2細胞KIM-1和NGAL釋放的影響

相較于空白對照組，GA刺激24 h后，HK-2細胞上清液中KIM-1和NGAL的水平均出現顯著上升(P<0.05)(圖2)。與GA組細胞對比，加入抗RAGE抗體(即GA+抗RAGE抗體組)與OA(即GA+OA組)可使KIM-1及NGAL的釋放均有所下降，且加入OA后能顯著下調HK-2細胞上清液中NGAL(P<0.05)；GA+OA組與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統計學意義(圖2)。

圖1 各組HK-2細胞KIM-1及NGAL mRNA水平Fig.1 mRNA expression of KIM-1 and NGAL in HK-2 cells

A: mRNA expression of KIM-1 in HK-2 cells；B: mRNA expression of NGAL in HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid..

圖2 各組HK-2細胞上清液KIM-1及NGAL蛋白釋放 Fig.2 Release of kidney injury molecule-1 in culture supernatants of HK-2cells

A: release of KIM-1 in culture supernatants of HK-2 cells；B: release of NGAL in culture supernatants of HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.3 GA與OA對HK-2細胞Toll樣受體信號通路mRNA表達的影響

與空白對照組相比較，GA組具有顯著升高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1、TLR7和TLR9 mRNA的表達(P<0.05)，其TLR2 mRNA無顯著性變化；并且，相較于單純GA刺激組，加入抗RAGE抗體以及OA后能顯著抑制上述上調作用(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組細胞Toll樣受體信號通路mRNA水平Fig.3 mRNA expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.4 GA與OA對HK-2細胞Toll樣受體信號通路蛋白表達的影響

各處理組細胞內中未檢測到TLR7和TLR9有效值。相較于空白對照組相，GA組具有較高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白表達，以上兩組間p38 MAPK與IRAK4差異有統計學意義(圖4A，4B)(P<0.05)。在加入OA后，細胞內p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白相對于單純GA刺激組顯著下降(P<0.05)，并與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統計學意義(圖4C，4D)。

3 討論

本研究應用GA刺激人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞)模擬DKD腎小管損傷的細胞模型，筆者觀察到GA能促進HK-2細胞KIM-1和NGAL等腎小管損傷相關分子的表達與釋放，并上調TLR1、TLR7、TLR9以及p38 MAPK與IRAK4等炎性反應通路關鍵激酶的表達，即GA可能通過激活Toll樣受體信號通路，在腎損傷過程中起重要作用。在GA刺激情況下分別加入OA和抗RAGE抗體，能夠顯著減弱GA對腎小管損傷相關分子及以上反應通路關鍵激酶信號傳導的促進作用，提示OA能夠干預GA調控的損傷。

DKD的具體發病機制尚未完全明確，許多因素參與其發病[5]。其中，高血糖環境能夠通過信號通路的改變、細胞因子的表達以及自由基的產生非酶促誘導形成AGEs，進而高血糖與AGEs共同影響腎小管的功能；RAGE屬于受體免疫球蛋白超家族，AGEs能夠通過與其的相互作用，觸發其二級信使途徑(secondary messenger pathways)的激活，參與DKD的發病機制[6]。

圖4 各組細胞Toll樣受體信號通路蛋白表達Fig.4 Protein expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

A: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of IRAK-4 HK-2 cells；B: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p38 MAPK in HK-2 cells；C: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TRL1 HK-2 cells；D: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TLR2 HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3；IRAK4: interleukin-1 receptor-associated kinase 4;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid;TLR: Toll-like receptor.

糖基化蛋白質GA為AGEs的前體之一，可反映近期(2～3周)平均血漿葡萄糖濃度，在臨床上作為監測血糖波動的指標。OA是一種具有抗炎、抗菌、降糖作用的天然抗氧化物，能夠降糖并改善DM。本研究模擬體外糖基化刺激腎損傷的細胞模型，將HK-2細胞置于人血清GA、GA+抗RAGE抗體組與GA+OA的環境中，觀察各情況下腎小管損傷相關分子和Toll樣受體信號通路的表達情況。

目前，OA在許多中藥及其制劑中皆作為定量指標，并于疾病模型中被廣泛研究，其中包括糖尿病和腎損傷。研究[7]顯示，STZ-誘導的糖尿病大鼠經OA處理后肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)有所升高，且腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)的下降存在OA劑量依賴性改善，作為腎功能損害的重要指標尿白蛋白也有所降低；糖尿病小鼠經OA治療一定時間后，Ccr與血漿胰島素濃度升高，AGEs相關物質如GA、糖化血紅蛋白及Nε-羧甲基賴氨酸等皆出現下降[8]。KIM-1表達于去分化的近端腎小管上皮細胞，在腎損傷時釋放到尿液中并且與腎小管間質的炎性反應和纖維化相關，被認為是早期腎損傷的標志物；NGAL是一種小相對分子質量分泌性蛋白，在腎臟受到損傷性刺激時由腎小管上皮細胞分泌至血液、尿液中，是診斷急性腎損傷有效的生物學標志之一[9-10]。本研究顯示，GA能顯著上調HK-2細胞中腎損傷相關分子KIM-1和NGAL的表達與釋放，而經過GA與OA共同處理后，KIM-1及NGAL的mRNA與蛋白水平有所下降，且與抗RAGE抗體封閉AGEs結合位點的實驗組差異無統計學意義，提示OA能夠干預GA調控的腎小管損傷。研究[11]表明，OA抵抗糖基化反應的作用不僅通過降糖效應而體現，而且還能夠直接有效抑制AGEs的形成，本實驗中以OA處理經GA刺激的HK-2細胞，其KIM-1及NGAL水平與抗RAGE抗體阻斷AGEs受體-配體結合實驗組無明顯區別，顯示OA可能通過降低腎臟糖基化反應引起的損傷，在DM及DKD病程中對腎臟具有保護作用。

近期研究[12-13]顯示，免疫與代謝系統結合緊密，Toll樣受體信號通路的激活能夠啟動信號級聯反應，導致細胞因子(趨化因子)的產生，從而引發炎性反應，并且參與非感染性炎性疾病(如糖尿病、癌癥和肥胖等)的發生發展。本課題組前期研究[3]顯示，GA能夠促進炎性細胞因子的分泌從而對腎小管造成損傷，此次實驗顯示，GA可顯著上調HK-2細胞TLR1、TLR7和TLR9 mRNA水平，以及p38 MAPK與IRAK4等Toll樣受體信號通路關鍵激酶的mRNA與蛋白表達，提示其能夠通過激活此通路而發揮作用。考慮到TLR7和TLR9存在于內溶酶體中[14]，mRNA經轉錄翻譯后蛋白表達量較低，因而通過Western blotting法并未檢測到二者有效值。當GA刺激組下分別加入OA，上述表達均顯著下降，且與抗RAGE抗體加入后的表達情況差異無統計學意義，表明OA能夠干預GA調控的Toll樣受體信號傳導，在抵抗糖基化反應過程中對腎臟具有保護作用。

綜上所述，GA作為AGEs前體能夠上調KIM-1和NGAL等腎損傷相關分子的表達與釋放，激活Toll樣受體信號通路，對人近端腎小管上皮細胞造成損傷；而具有降糖及改善DM作用的OA能夠有效干預GA調控的上述損傷。因此，對DM患者進行GA檢測，可提示與評估患者腎臟受累情況，預測DKD的發生發展；并且，將OA對糖尿病腎損傷的干預、治療作用通過進一步的臨床研究與驗證后應用于臨床治療，能夠為DKD的保護靶點與治療方案提供思路。