60Co-γ射線誘變小麥M3代品質性狀的遺傳變異分析

王停停，王 敏，張從宇

(1.安徽農業大學農學院/農業部黃淮南部小麥生物學與遺傳育種實驗室，安徽合肥 230036；2.安徽科技學院，安徽鳳陽 233100)

誘變育種技術可以創造具有高產、優質、抗病、抗逆等單一和復合優良性狀的新資源，是目前種質創新和挖掘新基因的一個重要途徑[1]。60Co-γ射線是作物育種最常用的輻射源。河南省農科院于1976年利用60Co-γ射線育成小麥新品種鄭六福[2]。印度于1967年利用60Co-γ射線和紫外線結合育成小麥品種SharbatiSonora[3]。在“十二五”期間，我國利用γ射線輻射育成小麥新品種4個[4]。在小麥品質性狀中，蛋白質和濕面筋含量是我國小麥粉質量評價的主要指標[5]，其中高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)主要影響小麥的烘烤品質[6-8]。面粉色澤也是影響面粉品質的重要指標之一，主要受小麥中多酚氧化酶(PPO)含量影響[9]。小麥脂肪氧化酶(LOX)活性是影響小麥品質和耐貯藏特性的因素之一，LOX活性越高，面粉的色澤越白，小麥面粉的面筋筋力越強[10]；LOX活性低則脂質的氧化反應速度降低，小麥的耐貯藏性增強[11-12]。目前，對小麥輻射誘變后代的研究主要集中在表型上，有關其品質性狀的研究相對較少。本試驗用60Co-γ 射線輻射鄭麥9023的干種子，以其M3代為研究對象，對其籽粒蛋白質含量、 濕面筋含量、 沉降值、 硬度、高分子量谷蛋白(GMP)含量、多酚氧化酶(PPO)活性和脂肪氧化酶(LOX)活性進行遺傳變異分析，旨在系統研究60Co-γ輻射對小麥品質性狀的誘變效果，以合理有效地利用有關變異資源，加快小麥品質育種的進程。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為鄭麥9023，2001年通過河南、湖北品種審定，經農業部質量監督檢驗測試機構品質測試，屬于強筋優質小麥。2002年經國家區域試驗取樣測定，其粗蛋白含量14.66%，濕面筋含量33.2%，HMW-GS組分為1A(Null)/1B(7+8)/1D(2+12)[13]。

1.2 方 法

1.2.1 誘變及其后代處理方法

2011年在國家林業輻照中心(合肥)采用200 Gy輻射劑量的60Co-γ射線照射3 000粒鄭麥9023干種子10 min。將輻射處理后的M1代于2011年秋單粒點播，單行區，行長1 m，行距20 cm，株距5 cm，收獲每株主穗，混脫，構成M2代種子。2012年秋種植M2代種子，種植 1 000株，收獲918個單株，單株脫粒計產保存。根據田間性狀從M2代群體中選取籽粒產量和蛋白質含量高的單株166株，于2013年秋種植成株系，構成M3代群體。M2代與M3代的種植方法同M1代。以上試驗材料均種植于安徽鳳陽安徽科技學院試驗田，田間管理同大田。以未處理的鄭麥9023為對照。

1.2.2 品質性狀測定

用瑞典波通公司的 DA7200 型近紅外谷物品質分析儀測定M3代株系籽粒的蛋白質含量、濕面筋含量、沉降值、硬度。 M3代全麥粉GMP含量測定參照Weegels等[14]和孫 輝等[15]的方法；LOX活性測定參照 Cato[16]的分光光度法；PPO活性測定參照Anderson等[17]的方法。

1.2.3 HMW-GS提取與分離

采用SDS-PAGE方法[18-19]鑒定HMW-GS組成。每份材料取1粒種子，從無胚端切取半粒，研磨，置于1.5 mL離心管中，加入50%(體積比)異丙醇500 μL。置于氣浴振蕩器中60 ℃振蕩30 min，10 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，反復提純三次。向離心管中加入200 μL樣品提取液(1%β-巰基乙醇，0.5 M Tris-HCl，pH為6.8，50%異丙醇)，置于氣浴振蕩器中60 ℃，1 h， 10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，加入120 μL樣品緩沖液(1%β-巰基乙醇，0.5 M的Tris-HCl，pH為6.8，4%SDS，20%丙三醇和 0.002%溴酚藍)，即可上樣或4 ℃低溫保存。

采用垂直板膠電泳，分離膠為10%(pH為8.5)，濃縮膠為3.75%(pH 為6.8)，電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液(pH為8.3)。以26 mA穩流電泳，指示劑出膠后1 h停止電泳。凝膠用染色劑(12.5%三氯乙酸+0.05%考馬斯亮蘭)染色過夜，蒸餾水脫色至背景清晰。脫色后的凝膠用凝膠成像系統對膠照相保存，用Qalityone軟件進行比較、分析。以鄭麥9023(Null/7+8/2+12)、中國春(Null/7+8/2+12)和淮麥20(1/7+8/2+12)[13]為對照。

1.3 數據處理

數據用SPSS統計分析，用Excel 2010作圖。變異株系的確定以超過群體均值±1.96×標準差[P(|u|≥1.96σ)≤0.05]為標準。

2 結果與分析

2.1 M3代群體的品質性狀

M3代群體品質性狀的分布如圖1～7，GMP含量和沉降值基本服從正態分布，蛋白質含量和濕面筋含量傾向于正偏態分布，硬度傾向于負偏態分布，PPO活性和LOX活性出現兩個峰。由表1可知，M3代群體的蛋白質含量、濕面筋含量、LOX活性均值高于親本，分別比親本高 1.4%、2.9%和18.7%；其中，濕面筋含量、LOX活性大于親本的株系占比均高于50%。M3群體的硬度、沉降值、GMP含量和PPO活性均值低于親本，分別比親本低2.4%、7.1%、29.0%和 19.2%。M3群體變異系數表現為硬度<濕面筋含量<蛋白質含量<沉降值

圖1 蛋白質含量次數分布圖

由表2可知，蛋白質含量和濕面筋含量均發生正向變異，獲得變異的株系5個(3.0%)和3個(1.8%)。硬度僅發生負向變異，獲得變異株系7個(4.2%)。獲得沉降值正向變異株系8個 (4.8%)、負向變異株系3個。GMP含量發生正、負向變異的株系均為3個。硬度和PPO活性均獲得7個(4.2%)負向變異；獲得PPO活性正向變異株系3個。LOX活性獲得正向變異的株系有5個(3.0%)，負向變異株系有4個(2.4%)。

圖2 濕面筋含量次數分布圖

圖3 沉降值次數分布圖

圖4 硬度的次數分布圖

2.2 M3代群體品質性狀間的相關性

由表3可知，蛋白質含量與硬度呈極顯著負相關，與濕面筋含量、沉降值、GMP含量呈極顯著正相關；濕面筋含量與沉降值、GMP含量呈極顯著正相關，與硬度呈顯著負相關；硬度與沉降值和PPO活性呈極顯著正相關；沉降值與PPO活性呈極顯著正相關；GMP含量與PPO活性呈極顯著負相關；PPO活性與LOX活性呈負相關，但不顯著。

2.3 M3代群體的HMW-GS組成變異

以鄭麥9023、中國春和淮麥20為對照，亞基按照Payne系統[20]命名，對M3代群體進行HMW-GS組成鑒定。在166個株系中，6個株系的HMW-GS組成從鄭麥9023的Null/7+8/2+12變為1/7+8/2+12。圖8為部分株系的SDS-PAGE電泳圖片。

圖5 GMP含量次數分布圖

圖6 PPO活性次數分布圖

圖7 LOX活性次數分布圖

2.4 HMW-GS亞基組成變異株系篩選

由表4可知，按照強筋小麥國家標準(GB/T 17892-1999)對蛋白質含量(≥15.0%)的規定，6個HMW-GS亞基組成變異株系的蛋白質含量均高于群體均值和親本，且均達到強筋小麥國家標準；濕面筋含量達到中強筋標準。按照弱筋小麥國家標準(GB/T17893-1999)對濕面筋含量(≤22%)和蛋白質含量(≤11.5%)的規定，變異株系中沒有弱筋小麥株系。6個HMW-GS亞基組成變異株系的籽粒硬度均高于群體均值和親本；PPO活性均高于群體均值，其中，株系163的PPO活性高于群體均值但低于親本；株系164的LOX活性低于親本和群體均值。

表1 M3代群體株系品質性狀的統計參數Table 1 Statistical parameters of quality characters of M3 generation

表2 M3代群體變異株系篩選Table 2 Selection of mutant plants in M3 generation

表3 M3代群體品質性狀間的相關系數Table 3 Correlation analysis of quality traits of M3 generation

*:P<0.05; **:P<0.01.

CK1:淮麥20; CK2:鄭麥9023; CK3:中國春；161～166:變異株系。

CK1:Huaimai 20; CK2:Zhengmai 9023; CK3:CS; 161-166:Mutation 161-166.

圖8 M3代HMW-GS亞基組成的SDS-PAGE電泳圖

3 討 論

60Co-γ射線一次急性照射實驗材料產生的染色體畸變可影響生物機體的形態、機能、生長發育及遺傳規律，但方向不可預測。Mago等[21]利用60Co-γ射線處理小麥，獲得了16株感稈銹病的突變體。張躍強等[22]將新春9號和新春6號雜交當代種子進行60Co-γ射線照射，經多代單穗選擇培育出早熟、優質、高產小麥新品種新春30號。張從宇等[23]利用60Co-γ射線輻射處理皖麥50，在M3代中篩選得到5個加工品質、沉降值、穩定時間和形成時間比皖麥50明顯提升和優化的變異穗行。本研究對60Co-γ射線照射產生的變異株系進行品質性狀鑒定，獲得了包括蛋白質和濕面筋含量高、PPO活性和LOX活性低、沉降值高等性狀優良的變異株系，進一步表明了60Co-γ射線誘變的廣譜性和有效性。本研究采用誘變與分子標記相結合的方法，對亞基突變株系的結構和突變機理進行深入研究，其結果對提高誘變選擇效率有重要參考價值，降低了誘變育種的盲目性和不確定性。

60Co-γ射線輻照對小麥后代的品質性狀有顯著影響[24-26]。本研究在M3代中獲得了6個未曾報道過的新的變異類型，例如分別具有低PPO活性和低LOX活性的小麥變異株系。研究表明，1亞基為優勢亞基，1和7+8亞基對面包烘烤品質指標具有較大的正向作用[27]，以1亞基代替N將顯著改善小麥的烘烤品質[28]。本研究在M3代中獲得了1亞基代替N的變異株系，具有較高的研究和育種價值。以上品質變異株系為小麥高分子量谷蛋白亞基分子機理研究和選育優異品質小麥品種提供了新的種質資源。