假禾谷鐮孢菌產孢條件研究

陸寧海，張 強,楊 蕊，霍云鳳，郎劍鋒，石明旺，陳錫嶺

(河南科技學院資源與環境學院植保系，新鄉河南 453003)

小麥莖基腐病(wheat crown rot)最早于1951年由澳大利亞昆士蘭州的Knight記載，該病害在澳大利亞的所有麥類種植區均有報道[1]。目前，莖基腐病已成為一種全球性的重要病害，在美國的西北太平洋區、南非、意大利、埃及和敘利亞、土耳其、西亞、南非和加拿大西部已發生[2]。在澳大利亞，莖基腐病造成小麥產量損失高達89%[3]。據調查，在澳大利亞，小麥莖基腐病造成減產所導致的直接經濟損失每年約為7 900萬澳元，間接損失大約為4.34億澳元[4-5]。

近幾年，莖基腐病在中國黃淮小麥主產區的河南、河北、山東、安徽、江蘇等省普遍發生；河南省焦作、許昌、商丘、新鄉等地部分麥田發生嚴重，而且呈現不斷加重和蔓延趨勢[6-10]。據本課題組調查，在河南省的部分地區，莖基腐病造成小麥減產達30%～50%。莖基腐病除了造成小麥產量損失外，還產生毒素，受害小麥作為食物或用作飼料，對人和牲畜的健康有極大威脅。本課題組前期研究表明，假禾谷鐮孢菌是引起河南豫北地區小麥莖基腐病的主要病原菌。有關該病害的致病機理、寄主抗性、病原檢測、遺傳變異等基礎研究需要大量的分生孢子作為材料，但假禾谷鐮孢菌在常規條件下培養時，產孢量偏少。本研究擬對假禾谷鐮孢菌的產孢條件進行初探，以期為小麥莖基腐病的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試病菌

假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)菌株由本課題組分離、鑒定、保存。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 產孢量的測定[11]

供試菌株活化7 d后，用直徑4 mm的打孔器在距離培養皿中心位置打取菌餅，接入到實驗設計平板的相同位置，置于實驗設計的培養條件下；培養10 d后，用直徑10 mm的打孔器打取4個菌餅置于10 mL的試管里，再加入1 mL的無菌水，在混均器上快速震蕩10 min，使孢子充分洗脫下來，然后鏡檢并計數。

1.2.2 最佳培養基的確定[12-14]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，分別接種于以下不同培養基上，于25 ℃培養10 d后測產孢量，每個處理重復三次。培養基種類如下：

(1)PDA培養基：馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(2)PSA培養基：馬鈴薯 200 g,蔗糖 20 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(3)燕麥片瓊膠培養基： 燕麥片30 g，瓊膠17～20 g，水1 000 mL。

(4)玉米粉瓊膠培養基： 玉米粉 300 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(5)理查固體培養基(Richard)： 硝酸鈉 10 g，磷酸二氫鉀5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)2.5 g，氯化鐵(FeCl3)0.02 g，蔗糖 50 g，瓊膠 17 g，水1 000 mL。

(6)查彼固體培養基(Czapek)：硝酸鉀2 g，磷酸氫二鉀1 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g，硫酸亞鐵(FeSO4) 0.01 g，蔗糖 30 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

(7)SDA培養基：葡萄糖40.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂12.0～15.0 g，水1 000 mL。

(8)麥芽糖培養基：麥芽糖 25 g，瓊膠17 g，水1 000 mL。

1.2.3 最佳碳源的確定[15]

基礎培養基為：蔗糖20 g，硝酸鉀5 g，磷酸鈉2 g，硫酸鎂1 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 000 mL。分別用等量的葡萄糖、甘露醇、果糖、麥芽糖與蔗糖置換，配成不同碳源培養基，按照1.2.1方法于25 ℃培養10 d后測產孢量。

1.2.4 最佳氮源的確定[16]

基礎培養基同1.2.3，分別用等量的蛋白胨、氯化銨、尿素、硫酸銨與其中的硝酸鉀置換，配置成不同氮源的培養基，按照1.2.1方法于25 ℃培養10 d后測產孢量。

1.2.5 最佳光照方式的確定[17]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，接種于PDA平板上，25 ℃下分別置于24 h連續光照、24 h連續黑暗、12 h光照與12 h黑暗交替，培養10 d后測量產孢量。

1.2.6 最佳培養溫度的確定[18]

移取1.2.1中直徑4 mm的活化菌餅，接種于PDA平板上，分別于15 ℃、20 ℃、25 ℃、 30 ℃、35 ℃培養10 d后測產孢量。

1.2.7 最佳pH值的確定[19]

用1% HCl(V/V)和1% NaOH(W/V)溶液將PDA培養基的pH值配成pH為3～11共9個梯度，將活化直徑為4 mm的活化菌餅接種于不同pH值的PDA平板，25 ℃培養10 d后測定產孢量。

1.3 數據處理

用Excel 2003 整理數據，用Duncan’s進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對病原菌產孢量的影響

由表1可以看出，在不同的培養基上假禾谷鐮孢菌的產孢量差異程度不同。PSA培養基和麥芽糖培養基上的分生孢子數量較多，分別為13.52×102和11.45×102個·cm-2，且顯著高于其他處理。其次是燕麥片培養基和SDA培養基上的產孢量，分別為 9.75×102和9.61 ×102個·cm-2。玉米粉培養基上的產孢量為6.51×102個·cm-2。査理培養基和査彼培養基均不利于產孢，產孢量分別為 3.36×102和2.91 ×102個·cm-2，顯著低于其他處理。 因此， PSA培養基和麥芽糖培養基為最佳培養基。

2.2 不同碳源對病原菌產孢量的影響

由表2可以看出，病原菌在以麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、果糖和甘露醇為碳源的條件下均能產孢，產孢量分別為15.61×102、8.76×102、5.28×102、2.34×102和1.46×102個·cm-2。不同處理間差異顯著，最有利于病原菌產孢的碳源是麥芽糖，其次是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇。故最佳碳源為麥芽糖。

2.3 不同氮源對病原菌產孢量的影響

由表3可知，病原菌以硫酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鉀和蛋白胨為氮源時均能產生孢子，其中以硫酸銨為氮源時的產孢量為13.31×102個·cm-2，顯著高于其他處理；氯化銨和尿素次之，產孢量分別為7.68×102和6.31×102個·cm-2；硝酸鉀和蛋白胨則不利于產孢，產孢量分別為2.32×102和2.14×102個·cm-2。因此，硫酸銨為最佳氮源。

表1 不同培養基對病原菌產孢量的影響Table 1 Effect of different medium on sporulation of Fusarium pseudograminearum

同列數據后不同字母表示處理間在0.05水平差異顯著。下表同。

Different lower-case letters following data indicate significant difference among the treatments at 0.05 level. The same in tables 2-6.

表2 不同碳源對病原菌產孢量的影響Table 2 Effect of different carbon sources on sporulation of Fusarium pseudograminearum

表3 不同氮源對病原菌產孢量的影響Table 3 Effect of different nitrogen sources on sporulation of Fusariumpseudograminearum

表4 不同光照對病原菌產孢量的影響Table 4 Effect of different light conditions on sporulation of Fusarium pseudograminearum

2.4 不同光照對病原菌產孢量的影響

由表4可知，病原菌產孢量在12 h光照和12 h黑暗交替條件下達到15.8×102個·cm-2，顯著高于其他處理，24 h連續光照和24 h連續黑暗條件下產孢量較低，分別為2.71×102和1.7×102個·cm-2。因此，最佳光照條件為12 h光照和12 h黑暗交替。

2.5 不同溫度對病原菌產孢量的影響

由表5可以看出，產孢量隨著溫度的升高而先升后降， 25 ℃時病原菌產孢量最大，為13.31×102個·cm-2，15～25 ℃處理間差異不顯著；溫度達到30 ℃時，病原菌產孢量急劇減少。因此，最佳培養溫度為25 ℃。

2.6 不同pH值對病原菌產孢量的影響

由表6可知，隨pH值升高，病原菌產孢量呈先增后減之勢，當pH值為8和9 時，產孢量分別為12.36×102和12.58×102個·cm-2，且顯著高于其他處理；隨pH值的繼續增大，產孢量逐漸減少。因此，最佳培養pH值為9～8。

表5 不同溫度對病原菌產孢量的影響Table 5 Effect of different temperatures on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

表6 不同pH值對病原菌產孢量的影響Table 6 Effect of different pH on the sporulation of Fusarium pseudograminearum

3 討 論

國內外學者對小麥莖基腐病的病原進行了大量研究， 但結果差異較大。Fernandez等[20]和Jefferson等[21]從加拿大小麥地下組織中分離得到木賊鐮孢菌(F.equiseti)、銳頂鐮孢菌(F.acumiuatum)、尖孢鐮孢菌(F.oxysporum)和燕麥鐮孢菌(F.aveuaceum)，但致病力均不高。其他學者在西北太平洋地區分離獲得根腐離蠕孢(Bipolarissorokiuiaua)、黃色鐮孢菌(F.culmorum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)、燕麥鐮孢菌(F.aveuaceum)和雪霉葉枯菌(Microdochiumnivale)，其中黃色鐮孢菌和假禾谷鐮孢菌對小麥的危害最大[22-25]。陳厚德等[26]認為，小麥莖基腐病的病原菌以鐮孢菌屬(Fusarium)種類為主，交鏈孢屬(Alternaria)次之，而且鐮孢菌屬(Fusarium)種類致病力較強。李 偉等[27]研究認為，小麥莖基腐病的病原菌主要種類是鐮孢菌(Fusarium)、根腐離蠕孢(B.sorokiuiaua)和雪霉葉枯菌(M.nivale)。綜合國內外學者研究，禾谷鐮孢菌(F.gramiuearum)、假禾谷鐮孢菌(F.pseudograminearum)和黃色鐮孢菌(F.culmorum)是大部分小麥種植區小麥莖基腐病主要病原菌種類，其中，假禾谷鐮孢菌是該病害的主要病原菌，如在美國太平洋西北地區，南非，澳大利亞昆士蘭州和新南威爾士州北部、阿根廷、意大利、埃及和敘利亞、土耳其、西亞和北非及加拿大西部等均有該病原菌被發現[28-30]。

假禾谷鐮孢菌引起的小麥莖基腐病危害嚴重，亟待探索分析該病原菌的成災機理、致病機制和寄主抗病性等問題，但是在常規培養條件下，病原菌不易產生孢子或孢子的數量太少,限制了研究工作的快速開展。因此，優化病原菌的產孢條件具有重要理論意義。

本試驗結果表明，假禾谷鐮孢菌在12 h光暗交替條件下產孢量顯著高于連續光照和連續黑暗條件下產孢量，最佳培養碳源、氮源、溫度、pH為麥芽糖、硫酸銨、25 ℃、8～9。