小麥 G6PDH基因的生物信息學分析及其低溫脅迫下苗期的表達特征

田 宇，彭瞰看，宋春華，于 萍，劉 楠，包雨卓，孟 婧，徐慶華，蒼 晶

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

植物在光照條件下，其綠色組織通過光合作用產生煙酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(NADPH)，并用于碳固定、脂肪酸合成和氮同化等過程。然而，當植物在黑暗中生長時，光合或非光合組織通過氧化戊糖磷酸途徑(OPPP)生成NADPH[1-2]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH-EC 1.1.1.49)是戊糖磷酸途徑的限速酶，能夠催化6-磷酸葡萄糖氧化生成6-磷酸葡萄糖酸-δ-內酯，同時生成NADPH[3]。NADPH通過與其他抗氧化酶的相互作用清除有害的活性氧，從而維持細胞的氧化還原平衡[4]。葉建仁和黃素紅發現松樹G6PDH活性高的針葉抗病性高于其他針葉[5]。Zhang等[6]發現馬鈴薯花葉病毒侵染煙草，會使煙草胞質和質體中G6PDH活性升高。當植物遭受低溫[7]、干旱[8]、鹽[9]等非生物脅迫時，其組織的G6PDH活性也均增加。可見，G6PDH在植物抵御生物及非生物脅迫時發揮重要作用。G6PDH分為細胞質G6PDH(cy-G6PDH)和質體G6PDH兩類，分別存在于胞質和質體中[10]，其中質體G6PDH又有P1(P1-G6PDH)和P2(P2-G6PDH) 兩種亞型[11]，不同亞型的G6PDH活性有所差別[12-13]。胞質亞型與質體亞型對還原力敏感性不同[14-15]，質體中P1-G6PDH又比P2-G6PDH對NADPH更敏感[16-17]。各亞型G6PDH是否發揮作用以及如何發揮作用，與其存在的位置及周圍環境有關。

小麥(Triticumaestivum)生長過程中會受到低溫、干旱、鹽堿、重金屬、病蟲害等各種生物及非生物脅迫，進而影響產量[18]。東農冬麥1號是東北農業大學自主培育的能克服黑龍江地區高寒氣候條件的強耐寒小麥品種。從實驗室前期東農冬麥1號的MicroRNA庫-靶基因KEGG通路分析中可知，G6PDH在低溫脅迫下差異表達[19]，因此判斷G6PDH在冬小麥抗寒性方面發揮著重要作用。本研究從Ensemble plants數據庫中(http://plants.ensembl.org/index.html)獲得 G6PDH蛋白序列及其基因序列，運用生物信息學手段對其基因結構進行分析，在此基礎上對小麥 G6PDH蛋白進行分類及理化性質分析，同時對低溫脅迫下強抗寒冬小麥品種東農冬麥1號和弱抗寒冬小麥品種濟麥22的分蘗節及葉片中該酶基因不同亞型的表達模式進行定量分析，以期為深入探究G6PDH在小麥抗寒性方面的功能奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用冬小麥為強抗寒性品種東農冬麥1號和弱抗寒性品種濟麥22，于2016年9月13日播種于東北農業大學試驗田中，完全區組設計，3次重復，行長2 m，行距0.2 m，10行區。播種量450粒·m-2，播深5 cm，常規田間管理。待大田自然降溫，連續10 d最低溫度平均為5 ℃(對照溫度，2016年10月8日)、0 ℃(2016年10月25日)、-10 ℃(2016年11月9日)和-25 ℃(2017年1月11日)時，隨機選取長勢一致的麥苗，剪取分蘗節和葉片，液氮速凍，-80 ℃ 保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 G6PDH序列的獲取與鑒定

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得G6PDH典型結構域序列，以其為標準序列，在Ensemble plants數據庫(http://plants.ensembl.org/index.html)、水稻基因組數據庫(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)、TAIR (https://www.arabidopsis.org/)上進行blast同源序列比對，分別獲得小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)中顯著同源的 G6PDH蛋白序列。利用在線工具 SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)和Pfam (http://pfam.xfam.org/)對候選 G6PDH蛋白序列進行保守結構域分析，去除不包含G6DPH結構域的蛋白序列，再利用軟件DNAMAN 8.0分別對3個物種的 G6PDH蛋白序列進行比對，去除冗余序列。隨后在基因組數據庫中獲取小麥 G6PDH蛋白相應的基因序列。

1.2.2 生物信息學分析

利用ProtComp 9.0 (http://linux1.softberry.com/berry.phtml)對候選小麥 G6PDH蛋白進行亞細胞定位分析。通過在線分析工具ExPASy-ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)預測 G6PDH蛋白的基本理化性質。利用在線預測軟件NPS-SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測G6PDH的二級結構，統計G6PDH二級結構中α-螺旋、β轉角、無規則卷曲和延伸鏈等結構所占的百分比。用ExPASy-SWISS MODE (http://swissmodel.expasy.org/)預測 G6PDH蛋白的三級結構。利用MEGA 6.0軟件中的鄰接法算法(Neighbor-Joining)將獲得的小麥 G6PDH蛋白序列分別與水稻、擬南芥中的同源蛋白序列構建系統進化樹，設置參數為：Bootstrap進行1 000次檢驗并去除支持率低于50%的節點，選取P-distance模型，Pairwise Deletion處理數據缺失。通過Ensemble plants數據庫獲得TaG6PDH基因全序列及CDS序列，利用GSDS (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)對TaG6PDH基因的結構進行分析。通過MEME (http://meme.nbcr.net/meme/)對 G6PDH蛋白進行保守Motif分析，設置參數為：Motif長度20～50個字符，最多可檢測到15個，并且允許顯示重復位點。

1.2.3 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

利用Ultrapure RNA kit(康為世紀，北京)分別提取越冬期分蘗節與葉片的總RNA。通過PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，日本)進行cDNA第一鏈的合成。具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.4TaG6PDH基因的qRT-PCR分析

從小麥G6PDH三種亞型中各選取一個基因進行qRT-PCR分析。根據TaG6PDH4(胞質亞型)、TaG6PDH5(P1亞型)、TaG6PDH11(P2亞型)基因序列設計實時定量引物(表1)，以Actin作為內參基因，在Mx-3000p Real-time PCR System(吉泰生物，上海)利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)對基因進行qRT-PCR分析，反應體系及程序參照試劑說明書。每個基因的表達分析均進行3次生物學重復，基因相對表達水平采用2-△△CT法進行 計算。數據顯著性分析利用SPSS軟件進行 計算。

2 結果與分析

2.1 小麥、水稻、擬南芥G6PDH同源序列的獲取

從NCBI上獲取 G6PDH蛋白的保守結構域PLN02539的氨基酸序列，隨后在小麥基因組數據庫上進行blastp同源比對，獲得26條蛋白同源序列，隨后通過在線工具SMART和Pfam去除不包含保守結構域的序列，再通過DNAMAN 6.0比對去除冗余序列，最終確定12條候選序列，分別命名為TaG6PDH1～12(表2)。隨后用相同的方法在水稻數據庫進行blastp同源比對，篩選后獲得4條水稻 G6PDH蛋白序列，分別命名為OsG6PDH1～4 (Acc:Os02g38840、Os07g22350、Os03g29950、Os03g20300)。最后在擬南芥基因組數據庫(TAIR)中下載 G6PDH蛋白序列，共6條，分別命名為AtG6PDH1～6(Acc:AT5G35790、AT5G13110、AT1G24280、AT1G09420、AT3G27300、AT5G40760)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequences

2.2 G6PDH蛋白的亞細胞定位及理化性質分析

ProtComp 9.0分析表明，小麥 G6PDH蛋白只存在于細胞質和質體兩個部位。這12條小麥 G6PDH蛋白，只有3條定位在細胞質，其余9條皆定位在質體中。利用ExPASy-ProtParam分析12條蛋白的理化性質(表2)，可以看出所有序列都含有20種氨基酸，序列長度在448～920 aa之間，最短的為TaG6PDH10和TaG6PDH11，最長的為TaG6PDH7。相對分子質量最大的是TaG6PDH7(103.22 kDa)，最小的是TaG6PDH3 (50.95 kDa)。理論等電點最低的是TaG6PDH6(4.98)，最高的是TaG6PDH9 (8.77)，其中等電點>7的有5條，<7的有7條。氨基酸不穩定指數均大于40，均為不穩定蛋白質。平均親水性系數均為負值，可見這12條蛋白質均為親水蛋 白質。

表2 G6PDH的理化性質Table 2 Physicochemical parameters of G6PDH

MW:分子量; pI:等電點。

MW:Molecular weight; pI:Isoelectric point.

2.3 TaG6PDH蛋白的二級及高級結構預測

蛋白二級結構是連接一級和高級結構的重要紐帶和橋梁。利用SOPMA對小麥TaG6PDH蛋白進行二級結構預測，結果發現TaG6PDH蛋白二級結構主要由α-螺旋、延伸鏈、β轉角和無規則卷曲4種成分組成(表3)。其中α-螺旋、無規則卷曲為主要成分，延伸鏈、β轉角相對較少。α-螺旋含量最高的是 TaG6PDH3，最低的是TaG6PDH9，無規則卷曲含量最高的是TaG6PDH12，最低的是 TaG6PDH7。以TaG6PDH1為例繪制二級結構圖，表明α-螺旋、無規則卷曲是構成 G6PDH蛋白的主要元件。

隨后利用SWISS-MODEL對TaG6PDH蛋白質的三級結構進行預測，結果與二級結構相一致，α-螺旋、無規則卷曲依舊是主要的結構元件，占據了很大一部分空間(圖略)。

表3 TaG6PDH蛋白的二級結構預測Table 3 Predicted secondary structure of TaG6PDH proteins

2.4 G6PDH蛋白的進化分析

將小麥、水稻、擬南芥 G6PDH蛋白進行系統發生樹的構建來分析它們之間的進化關系(圖1)。結果，G6PDH蛋白被分為4組，每組中都存在TaG6PDH、AtG6PDH、OsG6PDH。此外，還發現系統發生樹中有4對姐妹組合，分別是TaG6PDH3-TaG6PDH5、TaG6PDH11-TaG6PDH12、TaG6PDH6-TaG6PDH8、TaG6PDH1-TaG6PDH4。

2.5 小麥 TaG6PDH基因結構分析

12條小麥TaG6PDH基因大體可以分為4組(圖2)，其中TaG6PDH2、 TaG6PDH3、TaG6PDH5為第1組，它們的基因結構都是由4個外顯子與3個內含子構成。TaG6PDH10、TaG6DPH11、TaG6PDH12為第2組，其中TaG6PDH10、TaG6PDH11都由5個外顯子與4個內含子構成，只有TaG6PDH12是由4個外顯子與3個內含子構成。TaG6PDH6、 TaG6PDH7、TaG6PDH8為第3組，都是由6個外顯子與5個內含子構成。第4組由TaG6PDH1、TaG6PDH4、TaG6PDH9組成，這3條基因的結構沒有明顯規律，這可能與其在植物體內行使主要功能有關。

圖1 G6PDH蛋白的進化樹

圖2 小麥 G6PDH基因的結構

2.6 TaG6PDH蛋白的保守Motif分析

通過在線分析軟件MEME (http://meme.nbcr.net/meme/)對 G6PDH蛋白進行保守Motif分析(圖3)，結果可見，這15個Motif的長度范圍在20～50之間，通過Pfam上預測，可以發現Motif1～10中都存在G6PD_C結構域，Motif1、2、3、4、5、6、7、8、10均存在于12條 G6PDH蛋白中。與這9個Motif相比，Motif11只存在于 TaG6PDH3、TaG6PDH6、TaG6PDH11中；Motif12只存在于 TaG6PDH7、TaG6PDH8中；Motif13只存在于TaG6PDH2、TaG6PDH5中；Motif14只存在于TaG6PDH8中；Motif15只存在于TaG6PDH1、TaG6PDH4中。而Motif 9既不普遍存在于12條G6PDH蛋白中,也不個別存在于某幾個蛋白中。此外Motif3中存在底物結合位點(RIDHYLGKEL)，Motif4中存在NADP+結合位點(NEFVIRVQP)[11]，這2個Motif都保守存在于12條TaG6PDH蛋白中。

圖3 小麥 G6PDH蛋白的保守Motif

2.7 低溫脅迫下 TaG6PDH的表達特征分析

分別從小麥G6PDH不同亞型中選取了3個基因(TaG6PDH4、TaG6PDH5、TaG6PDH11)進行低溫脅迫下的表達模式分析。表4中東農冬麥1號和濟麥22分蘗節及葉片中基因表達量均以 5 ℃為對照。胞質亞型TaG6PDH4在兩個冬小麥品種的分蘗節和葉片中的表達量均隨著溫度的降低而逐漸升高，并且都在-10 ℃時快速升高，-25 ℃達到最大值。P1亞型TaG6PDH5在兩個冬小麥品種的分蘗節中，隨著溫度的降低，表達量呈現先升高后降低的趨勢，在-10 ℃時達到最高；而在葉片中，基因表達量的變化則是呈現逐漸升高的趨勢，同樣在-10 ℃開始快速升高， -25 ℃達到最大值；從表達量變化倍數上可以看出，TaG6PDH5葉片中的表達量要高于分蘗節。P2亞型TaG6PDH11在兩個冬小麥品種分蘗節和葉片中的表達量變化隨著溫度的降低雖然也呈現上升的趨勢，但變化倍數明顯低于前兩個基因(表4)。從3個基因的表達模式中可以看出，TaG6PDH的不同亞型隨著溫度的變化以及組織部位的不同，基因表達模式也有所區別。

3 討 論

本研究表明，小麥 G6PDH蛋白只存在于細胞質與質體中，這與前人的報道結果一致[20]；所分析的12條小麥 G6PDH蛋白中，有3條定位在細胞質，9條定位在質體，即質體中的同工酶數量大于細胞質中同工酶的數量，這與其他植物中 G6PDH蛋白的分布規律相一致[21]。

系統發生樹中擬南芥、小麥和水稻的G6PDH具有很近的親緣關系，證明G6PDH在進化上高度保守[22]。從先前報道中可知，擬南芥AtG6PDH5、 AtG6PDH6屬于胞質亞型； AtG6PDH1屬于質體P1亞型；AtG6PDH2、 AtG6PDH3屬于質體P2亞型； AtG6PDH4比較特殊，定位在質體中，但并不屬于P1、P2任何一種亞型[23]。因此，從進化關系上可以推斷小麥的TaG6PDH1、TaG6PDH4、TaG6PDH9屬于胞質亞型；TaG6PDH2、 TaG6PDH3、TaG6PDH5屬于P1亞型；TaG6PDH10、TaG6PDH11、TaG6PDH12屬于P2亞型。小麥的TaG6PDH6、 TaG6PDH7、TaG6PDH8與擬南芥的 AtG6PDH4親緣關系較近，推斷這3條蛋白定位于質體，但并不屬于已知的任何一種亞型，具體功能有待后續研究。小麥不同亞型的TaG6PDH基因結構也有所差別，主要表現在外顯子與內含子數量上的變化，這可能是由結構性的分化機制所導致的，例如，外顯子和內含子的插入或缺失以及外顯子化和偽外顯子化[24]。12條小麥TaG6PDH蛋白Motif排列大體相近，Motif3中存在的底物結合位點(RIDHYLGKEL)與Motif4中存在的NADP+結合位點(NEFVIRVQP)，保證了TaG6PDH蛋白的基礎功能。

表4 低溫脅迫下 TaG6PDH基因的表達模式Table 4 Expression patterns of TaG6PDH under cold stress

同一基因、同一列數據后的大、小寫字母不同分別表示不同溫度處理之間的差異達到了0.05和0.01顯著性水平。

The upper and lower case letters within the same gene and the same column following the data indicate significant differences between different temperature treatments at 0.05 and 0.01 levels.

低溫脅迫下兩個冬小麥品種分蘗節中胞質亞型TaG6PDH4的基因表達量呈現逐漸升高的趨勢，并且基因表達量變化倍數要遠高于其他兩種亞型的TaG6PDH基因，表明胞質亞型TaG6PDH4在冬小麥響應低溫脅迫時發揮了主要作用。有文獻報道，P1亞型在葉片等綠色組織中表達較高[25]。本實驗中，低溫脅迫下P1亞型TaG6PDH5基因在分蘗節中雖也有較高表達，但與其在葉片中的基因表達量變化相比依舊有很大差距，因此可以推斷，低溫脅迫下P1亞型 TaG6PDH主要是在葉片等綠色組織中發揮作用；而P2亞型TaG6PDH11基因表達量在分蘗節及葉片中都沒有較大的變化，但整體趨勢依舊是隨著溫度的降低而升高，可見，不同亞型的TaG6PDH對溫度脅迫反應不同，但總體表現為 TaG6PDH在小麥抗寒方面發揮正向積極作用。東農冬麥1號是強抗寒冬小麥品種，而濟麥22號則是弱抗寒品種，無論是在分蘗節還是葉片中，3種亞型的TaG6PDH基因在東農冬麥1號中的表達量變化倍數都要遠高于濟麥22，因此，可以認為TaG6PDH表達量變化可以作為判斷小麥抗寒強弱的一種指標。