超聲波協同纖維素酶提取黃精多糖的工藝優化研究

趙志君，任 婧

（山西省醫藥與生命科學研究院，山西 太原 030006）

0 引言

黃精又名老虎姜和雞頭參，是百合科多年生草本植物，屬于藥食同源中草藥[1]。黃精的藥性平、味甘，具有滋陰潤燥的功效，是我國傳統中藥常用藥物之一[2]。

糖類是黃精根莖的主要成分，其次還含有甾體皂苷類、黃酮類等[3]。其成分中多糖含量最高，但由于環境差異，各地產黃精的多糖含量也有所不同[4]。經研究表明，黃精中的多糖具有抗衰老、抗腫瘤、增強免疫力、抗氧化損傷、降血脂及降血糖等多種生物活性[5-7]。

近幾年來，黃精多糖的含量測定和提取方法僅見報道，試驗對黃精多糖提取方法進行了優化，以期為黃精開發及利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃精，原產地湖北省，購于萬民藥房；纖維素酶（10萬U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；去離子水。

WGL-230B型電熱鼓風干燥箱、FW135型粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；WB-4型電熱恒溫水浴鍋，常州市崢嶸公司產品；UV754型紫外可見分光光度計，上海精密儀器有限公司產品；SB-5200DTD型超聲波清洗器；KQ-SOODE型數控超聲波，昆山市超聲儀器有限公司產品；92SM-202A型電子天平；PB-10酸度計。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃精的預處理

置于烘箱里在60℃下烘干，用粉碎機將其粉碎，過80目篩，備用。

1.2.2 黃精多糖粗提取方法

準確稱取2.000 0 g黃精粉末，藥材與水按比例加入錐形瓶中，稱取適量纖維素酶，用濃度為0.1 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，將溶液調至固定pH值。在超聲功率、溫度固定的前提下，提取相應時間，取出后滅酶10 min，趁熱過濾，將濾液用水浴鍋濃縮、冷卻、定容至2 mL，加入一定倍數的無水乙醇，混勻后置冰箱中冷藏靜置過夜，用濾紙將上清液濾去，得多糖沉淀，用適量水溶解定容至50 mL得多糖待測液。

1.2.3 多糖測定方法多糖測定方法

（1） 硫酸-苯酚比色法。得標準曲線為：Y=0.070 94X-0.004 99，X為多糖質量濃度，Y為吸光度，R2=0.999 3。

式中：C1——由回歸方程算得的多糖質量濃度，mg/mL；

V1——多糖稀釋后的體積，mL；

m——黃精干物質量，g。

（2） DNS法。制得標曲為：Y=7.016 6X-0.020 55，X為還原糖質量濃度，Y為吸光度，R2=0.998 3。

式中：C2——由回歸方程計算得的還原糖質量濃度，mg/mL；

V2——還原糖稀釋后體積，mL；

m——黃精干物質量，g。

1.2.4 苯酚溶液的配制

精密稱量2.5 g苯酚，用蒸餾水溶解后，先超聲溶解，然后定容于50 mL容量瓶中。

1.2.5 DNS溶液的配制

精密稱量0.65 g DNS，先加適量蒸餾水超聲溶解，再加32.5 mL濃度為2 mol/L的NaOH溶液，再加入4.5 g丙三醇，用蒸餾水定容于100 mL容量瓶中。

1.3 標準曲線制作

精密吸取1 g/L葡萄糖標準品溶液各0.2，0.6，1.0，1.4，1.8 mL，加蒸餾水至4 mL，再依次用移液器加入5 mL的DNS溶液，搖勻，于沸水中煮沸5 min后取出，冷卻至室溫，然后定容至10 mL，以空白為對照，于波長540 nm處測吸光度。用吸光度值作縱坐標、葡萄糖質量濃度作為橫坐標，繪制標曲Y=7.016 6X-0.020 55，在0.2～1.8 mg呈線性關系，用作DNS法測定還原糖。

精密量取1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL于 6只大試管中，各加蒸餾水至2 mL，分別取5%苯酚溶液1 mL，之后迅速加入5 mL的濃硫酸溶液，搖勻，沸水浴加熱15 min，冷卻至室溫，用空白作對照，于波長490 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標、葡萄糖質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線Y=0.070 94X-0.004 99（R2=0.999 3），0～18μg呈線性關系，用于苯酚-硫酸法測定總糖。

1.4 單因素試驗

在固定其他因素的條件下，用黃精多糖作為提取率指標，單因素試驗時，研究了纖維素酶與底物質量比、超聲功率、超聲時間、液料比、浸提pH值對多糖提取率的影響。

纖維素酶與底物質量比分別為1%，2%，3%，4%，5%；超聲功率分別為 100，150，200，250，300 W；超聲時間分別為20，40，60，80，100 min；料液比分別為 1∶8， 1∶10， 1∶15， 1∶20， 1∶25；浸提pH值分別為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0。

1.5 正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，將纖維素酶與底物質量比（A）、超聲功率（B）、超聲時間 （C）、料液比（D）、浸提pH值（E） 作為考查因素，為每個因素選4個水平，按L16（45）通過正交設計，多糖提取率作為指標進行試驗。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

1.6 統計分析

采用正交設計軟件對正交結果進行統計分析，確定最佳提取工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 纖維素酶與底物質量比對提取率的影響

纖維素酶與底物質量比對提取率的影響見圖1。

由圖1可以看出，隨著纖維素酶與底物質量比的增加，多糖的提取率隨之增加，當比值達到3%時多糖提取率達到最大，比值再增加，多糖提取率又稍有下降，最后選擇質量比3%。

2.1.2 料液比對提取率的影響

圖1 纖維素酶與底物質量比對提取率的影響

料液比對提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對提取率的影響

由圖2可以看出，隨著料液比的增加，多糖的提取率逐漸提高，當料液比為1∶15時，提取率達到最大值，隨著料液比的增加，多糖的提取率又有所下降，所以選擇料液比1∶15。

2.1.3 浸提pH值對提取率影響

浸提pH值對提取率的影響見圖3。

圖3 浸提pH值對提取率的影響

由圖3可以看出，浸提pH值在3.0～5.0時，多糖的提取率呈上升趨勢；在5.0時達到最大值，隨著浸提pH值增加，提取率又降低。說明適宜的浸提pH值有利于酶和底物的結合，所以選擇pH值為5.0。

2.1.4 超聲時間對提取率的影響

超聲時間對提取率的影響見圖4。

由圖4可以看出，隨著提取時間的增加，提取率在60min時最大，隨著超聲時間的增加，又有一定的降解。所以選取超聲時間60 min。

2.1.5 超聲功率對提取率的影響

超聲功率對提取率的影響見圖5。

圖4 超聲時間對提取率的影響

圖5 超聲功率對提取率的影響

由圖5可以看出，多糖提取率在超聲功率100～200 W時達到一個比較穩定的值，而且提取率達到最大，功率再增大，提取率又下降。因為當超聲功率在一定的強度內可以促進酶的反應，但功率過大時酶結構會發生不可逆變化[8]；另外，功率過大，會使多糖發生降解，所以選擇超聲功率為100～200 W。

2.2 正交試驗

L16（45）正交試驗設計及結果見表2。

表2 L16（45）正交試驗設計及結果

由表2可知，影響多糖提取率的最佳提取工藝為A3B1C2D1E2。即纖維素酶與底物質量比3%，超聲功率100 W，超聲時間60 min，料液比1∶8，浸提pH值5.0。

多糖提取率方差分析見表3。

表3 多糖提取率方差分析

通過表3方差分析可以看出，因素A和因素E對提取率有顯著性影響，說明二者對多糖提取率起主要作用，因素B，C，D則沒有顯著性差異，即三者對提取率影響最小，由此可以得出影響多糖提取率的因素依次為 E＞A＞B＞C＞D。

2.3 驗證試驗

在優化后的條件下進行3次平行試驗。

驗證試驗結果見表4。

表4 驗證試驗結果

從表4中可看出，多糖提取率平均值為37.26%。

3 結論

通過單因素試驗和正交試驗，采用超聲波協同纖維素酶方法，得出黃精多糖最佳提取條件為纖維素酶與底物質量比3%，超聲功率100 W，超聲時間60 min，料液比1∶8，浸提pH值5.0。與傳統的單獨水浴法相比，超聲波協同纖維素酶方法提取效率高、速度快，是一種值得探索的新方法。