白藜蘆醇對肺腺癌95D裸鼠移植瘤增殖及轉移的影響

陳海霞

【摘 要】本文通過皮下接種和尾靜脈注射建立裸鼠皮下移植瘤及靜脈轉移瘤模型，采用完全隨機分組方法分為生理鹽水對照組和白藜蘆醇組（100mg/kg），腹腔注射白藜蘆醇進行治療，NightOWLⅡLB983動物成像儀測定皮下移植瘤生長狀況和肺轉移灶改變，移植瘤標本進行病理學觀察，免疫組化檢測MMP2、TIMP2表達變化。得出白藜蘆醇有抑制肺腺癌細胞增殖效應，并具有抑制腫瘤細胞侵襲、轉移作用，其機制可能涉及對MMP2、TIMP2表達的調控。

【關鍵詞】白藜蘆醇;肺腫瘤;裸鼠

【中圖分類號】R539【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2019）13-0-02

肺癌是我國發病率和死亡率占第一位的惡性腫瘤，臨床上預后較差，也是近年來重要的抗腫瘤研究對象，1940年首次從毛葉葉黎蘆的根部分離得到白藜蘆醇（resveratrol， Res），其是一種活性非黃酮多酚物質，在植物受到病原性進攻或環境惡化時產生。近年來又發現白藜蘆醇具有抗腫瘤作用，對肺癌細胞有明顯的抑制增殖和誘導凋亡的作用，本實驗主要研究白藜蘆醇對肺癌移植瘤的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與細胞株

Luciferase-95D細胞珠購自賽業生物公司;基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase， MMP2）、金屬蛋白酶組織抑制劑2（tissue inhibitors of metalloproteinase， TIMP2）購自Sant Cruz公司，Matrigel購自美國BD公司;BALB/C裸鼠，6-8周齡，體重20-25g，由同濟大學實驗動物科學部提供等。

1.2 裸鼠飼養 裸鼠飼養于同濟大學實驗動物中心SPF屏障系統的潔凈層流架內，相對濕度40%-60%，溫度25℃，實驗裸鼠所用鼠籠、墊料、食物、水等均經過消毒處理。

1.3 肺癌細胞移植瘤模型的建立 取對數生長期Luciferase-95D細胞，經消化、離心，制備5×106個/ml細胞懸液，每只裸鼠背部皮下種植0.2 ml細胞懸液形成皮下移植瘤，尾靜脈種植0.2ml細胞懸液形成肺轉移瘤，待瘤增長至100mm3，按完全隨機分組方法將裸鼠分成對照組和白藜蘆醇組，分組5只，進行給藥，白藜蘆醇組給于100mg/kg/d，對照組給于等體積的生理鹽水對照，給藥途徑均為腹腔注射，每天1次，每5天活體熒光成像儀測量一次腫瘤結節的光量子強度，繪制各組腫瘤的生長曲線。

1.4 移植瘤組織病理學觀察 末次給藥6 h后實驗結束將裸鼠拉頸處死，取皮下移植瘤和肺轉移瘤，10%的福爾馬林固定過夜，標本經脫水、透明、浸蠟、包埋、切片等步驟常規制備出瘤組織石蠟切片，經過蘇木精-伊紅染色，應用光學顯微鏡觀察各組移植瘤組織結構的變化。

1.5 免疫組織化學檢測移植瘤MMP-2、TIMP-2的表達 制備好的石蠟切片脫蠟，按免疫組織化學反應步驟操作：第一抗體基質金屬蛋白酶-2和基質金屬蛋白酶抑制劑-2均為1∶200稀釋;山羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標記）稀釋度1∶300，各步驟間用PBS充分浸洗，30%甘油封片，顯微鏡下觀察。

1.6 統計學處理 采用SPSS 19.0統計學軟件進行統計學分析，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD檢驗，計量資料符合正態分布，使用表示，檢驗水準α=0.05。

2 實驗結果

2.1 裸鼠治療前后一般情況變化 應用白藜蘆醇治療期間裸鼠進食、飲水等均未發生明顯變化，但是隨治療時間的延長，白藜蘆醇實驗組個別裸鼠體重減輕明顯，有的裸鼠出現短暫的腹瀉、便血，無需治療，停藥后既可自行緩解，考慮胃腸道受藥物刺激所致，實驗期間裸鼠均未出現意外死亡。

2.2 白藜蘆醇對裸鼠移植瘤的抑制作用 裸鼠用藥期間每5天一次活體熒光成像儀觀察結果顯示，對照組皮下移植瘤生長較快，白藜蘆醇處理組腫瘤生長緩慢，實驗組與對照組有顯著差異（P<0.01）;尾靜脈肺轉移瘤觀察，可見對照組肺部瘤結節較實驗組多且大。白藜蘆醇處理組瘤結節小，多為0-2個，說明白藜蘆醇對肺癌轉移有一定抑制效應。

2.3 裸鼠瘤組織病理學觀察白藜蘆醇誘導裸鼠肺癌移植瘤細胞凋亡情況

對照組皮下移植瘤切片中腫瘤細胞呈上皮樣，內外膜完整，核漿比例高，分裂象多見，未見明顯壞死灶;白藜蘆醇治療組，瘤塊中癌細胞排列較紊亂，可見大量核固縮或碎裂的瘤細胞，瘤組織間有較多的片狀壞死灶，并可見炎癥細胞浸潤。肺組織切片顯示，肺組織內有大量轉移瘤灶，部分相互融合，肺組織實變;并可見瘤細胞侵犯血管和氣管壁;Res組肺組織中僅見到少量小瘤結節，肺組織結構完整，部分可見肺泡隔充血。

2.4 免疫組織化學檢測白藜蘆醇對MMP2、MMP11、TIMP2表達的變化

裸鼠移植瘤石蠟切片免疫組化染色結果顯示，MMP2蛋白表達隨白藜蘆醇濃度的增加表達下降，TIMP2則升高，可能與肺癌轉移有關。

3 討論

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，其化學名稱3，4，5'-三羥基苯二烯，是一種活性非黃酮類多酚化合物，已在72中植物中被發現，近年來備受關注，體外及動物體內實驗結果表明白藜蘆醇能抑制腫瘤細胞的生長，具有抗腫瘤活性，是非常有前景的天然抗腫瘤藥物，被喻為又一新的綠色抗腫瘤藥物[]。本研究結果顯示也證明白藜蘆醇可抑制裸鼠移植瘤的生長并促進其細胞凋亡。

侵襲和轉移是惡性腫瘤最本質的特征和最普遍的一種生物學行為，是一個多因素、多步驟、多階段的復雜過程[]，涉及腫瘤細胞粘附，對細胞外基質的降解，新生血管的長入。本研究顯示，裸鼠移植瘤細胞MMP-2表達下降，而TIMP-2表達增高，由此可以抑制95D細胞對基膜降解和基膜的黏附，降低腫瘤細胞侵襲轉移能力。因此，MMP2/TIMP2的表達水平有可能作為預測肺癌惡性程度的生物學指標。

總之，本研究通過體內外實驗證實白藜蘆醇具有抑制肺癌的增殖和轉移作用，下調移植瘤細胞MMP2的表達，同時上調TIMP2的表達可能是白藜蘆醇抑制肺癌轉移的機制之一，為腫瘤治療提供新的選擇，但其抗腫瘤侵襲、轉移機制有待進一步研究明確。

參考文獻

劉紅山， 潘承恩， 齊詠， 等. 白藜蘆醇合用5-FU對小鼠移植肝癌H22生長的影響[J]. 世界華人消化雜志， 2002， l0（1）： 32-35

Yokota J.Tumor progression and metastasis.Carcinogenesis.2000， 21（3）：497—503.