破傷風梭菌芽孢玻片標本制作的改進及體會*

徐珠錦 劉 軍 謝文熙 陳 傳 郭 震

廣東醫科大學病原生物學實驗室,廣東省湛江市 524023

不同細菌的芽孢形態和位置有較大差異，因此直接觀察細菌的芽孢可作鑒定細菌的方法之一[1]。破傷風梭菌玻片標本是微生物實驗教學不可缺少的標本，學生可通過破傷風梭菌玻片標本掌握芽孢形態結構和加深已學知識的理解。以往，我們傳統制作破傷風梭菌玻片標本的方法主要有皰肉湯培養基和血平板培養基取菌液涂片方法，可是這兩種方法制作的標本鏡下觀察不清晰或芽孢量少。我們在長期的醫學微生物學實驗準備過程中發現，通過用血清葡萄糖培養基代替傳統方法培養破傷風梭菌制作的玻片標本，可以克服上述不足。同時又能制成長期保存的染色標本，以滿足教學的需要，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌種 為本實驗室保存的破傷風梭菌ATCC19406。

1.2 20%血清葡萄糖培養基的制備 取營養瓊脂培養基3.3g加入蒸餾水100ml混勻溶解，高壓滅菌后待培養基冷卻至55～60℃時加入無菌20%葡萄糖20ml和無菌兔血清25ml混合輕輕搖晃均勻，傾注在15cm×10cm無菌平板上，冷卻凝固后放置冰箱備用。

1.3 染色液的配制 結晶紫染液：稱取結晶紫8g，溶于100ml 95%乙醇中制成飽和液。取20ml飽和液于80ml 10g/L草酸銨溶液混合即成，過濾后備用。結晶紫購于國藥集團化學試劑有限公司，95%乙醇購于廣州友聯化學試劑廠。盧戈碘液：先將2g碘化鉀溶于10ml蒸餾水中，再加1g碘，待碘全部溶解后加300ml蒸餾水。碘化鉀和碘購于國藥集團化學試劑有限公司[2]。

1.4 破傷風梭菌芽孢玻片標本的制作 傳統的方法為將破傷風梭菌ATCC19406種于皰肉湯培養基中，放37℃培養箱培養48h，取培養液2ml經2 000r/min離心，沉渣重復洗絳2次，用接種環取菌液2環輕輕放置于載玻片上，放室溫自然干燥，火焰加溫固定。用孔雀綠水胞染色法進行芽孢染色[2-4]。

改進的方法為先按常規將分離后純種的破傷風梭菌種在血清葡萄糖培養基平板上，放置于裝有2小包厭氧產包的圓底立式厭氧培養袋中37℃培養箱培養48h， 隨后在無菌空平皿中放5ml無菌生理鹽水，首先在無鹽水的地方用接種環刮取破傷風梭菌平板的菌苔于空平板上研磨，然后與鹽水混勻。菌液放置5min后，取上清液涂片。放室溫自然干燥，火焰加溫固定。先用結晶紫溶液染1min，流水沖洗，用盧戈碘液媒染1min，流水沖洗，95%酒精脫水20s。染色待其自然干燥，2周后用中性樹膠蓋上蓋玻片封片。營養瓊脂培養基購自北京奧博星有限公司。2.5L圓底立式培養袋購自青島海博生物技術有限公司。日本三菱MGC厭氧產包購自三菱瓦斯化學株會社。載玻片購于鹽城匯達醫療機械有限公司。蓋玻片鹽城匯達醫療機械有限公司。中性樹膠購自中國上海標本模型廠。

2 結果

圖1顯示，傳統方法制得的標本背景臟，芽孢結構不清晰，在一個視野里細菌芽孢極少。圖2顯示，改進方法制得的標本背景清潔，形態結構完整清晰，在一個視野里幾乎所有細菌都有芽孢形成。經過染色后芽孢內部為無色空泡，呈典型鼓槌狀。

圖1 傳統方法的破傷風梭菌芽孢

圖2 改良方法的破傷風梭菌芽孢

3 討論

傳統方法的破傷風梭菌芽孢之所以明顯少于改良方法，分析原因可能如下：(1)皰肉湯培養基和血瓊脂平板雖然營養成分均不是非常豐富，但相對于皰肉湯培養基來說營養成分過低，因此影響破傷風梭菌芽孢的繁殖生長。(2)破傷風梭菌屬于嚴格厭氧的腐物寄生菌，芽孢是在細菌繁殖不利的條件才形成，是細菌抵抗不良環境的反應[5]。血清葡萄糖培養基平板因為缺乏C、N、P元素也可導致芽孢生成基因高表達從而使破傷風梭菌的芽孢形成增多[6]。(3)厭氧環境不同：破傷風梭菌為嚴格厭氧菌，必須在完全無氧的環境下培養才產生芽孢。傳統的皰肉湯培養基是利用皰肉消耗液體中的氧氣，使培養基達到缺氧環境，但皰肉消耗液體中的氧氣非常有限，根本無法達到完全消耗液體中的氧氣，而厭氧產氣袋方法培養，操作方便簡單，可通過化學反應完全消除厭氧袋中的氧氣，造成厭氧效果更加明顯。(4)傳統的孔雀綠水芽孢染色法，染色時間長，操作繁瑣，芽孢著色淺，對比不明顯[7]，而結晶紫可使菌體和芽孢外膜著上紫色，但芽孢對水溶性染料的滲透能力差，芽孢不著色，加之折光系數高，從而導致外膜及菌體輪廓格外清晰，隨后95%酒精短時間脫色使視野背景更加清潔[8]。

值得注意的是，采用制備血清葡萄糖培養基要注意加樣的順序，正確的加樣順序應是：第一步取營養瓊脂培養基3.3g加入蒸餾水100ml混勻溶解后高壓滅菌，第二步是等上述營養瓊脂培養基冷卻在55～60℃時取已準備好滅菌的20%葡萄糖20ml加入培養基中混均，第三步將滅活兔血清25ml加入培養基中混合均勻，這因為兔血清較黏稠難混合均勻，先加葡萄糖容易混合均勻，既可以降低培養基溫度，又達到不破壞兔血清營養成分，同時又可避免營養瓊脂培養基凝固過快，這樣才能保證所配制的培養基混合均勻，取菌液染色時背影干凈。

綜上所述，改進方法制備的教學標本片，在一張標本片上可以看到破傷風梭菌的形態和芽孢結構，以及染色后呈革蘭陽性菌，便于學生觀察和理解。